2.4.1. Các chất điều hòa sinh trƣởng [6]
Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào cho thấy:
- Chất điều hòa sinh trưởng cần thiết cho nuôi cấy tế bào
- Chất điều hòa sinh trưởng ảnh hưởng đến quá trình biệt hóa tế bào hình thành cơ quan như chồi, thân , lá, rễ.
- Chất điều hòa sinh trưởng ảnh hưởng đến sự tổng hợp các chất thứ cấp và cấu trúc tế bào: auxin cần thiết cho nuôi cấy tế bào như IAA, NAA, 2,4-
Dichlorophenoxy acetic acid và cytokinin như Kinetin và BA (Benzyladenine). Chất sinh trưởng tác động riêng lẽ hay phối hợp trong cùng nhóm hay cả hai nhóm đến sự sinh trưởng tế bào và tổng hợp các chất thứ cấp. Nồng độ chất sinh trưởng được sử dụng từ 1 đến 10 mg/l.
2.4.2. Nguồn đạm
Chủ yếu là đạm hòa tan, đạm dạng nitrat hay hỗn hợp đạm nitrat và amonium. Đôi khi sử dụng casein hydrolysate hay nguồn đạm tự nhiên.
2.4.3. Nguồn cacbon
Sucrose là nguồn cacbon và năng lượng chủ yếu được sử dụng trong nuôi cấy mô. Trong nhiều trường hợp hàm lượng cacbon cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào và sản lượng của các chất trao đổi thứ cấp... Đôi khi phụ thuộc vào các loại cây trồng mà sử dụng mannose, galactose hay glucose. Loại đường và nồng độ đường được sử dụng cũng ảnh hưởng đến nồng độ các chất thứ cấp được thu nhận.
2.4.4. Nhiệt độ, pH, ánh sáng và oxygen [26]
Nhiệt độ, pH, ánh sáng và oxygen là tất cả những thông số cần được kiểm tra trong nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp.
- Nhiệt độ từ 17 - 25oC thường được dùng trong nuôi cấy tạo callus và phát triển tế bào nuôi cấy. Nhưng mỗi loại cây sẽ thích hợp với một nhiệt độ cụ thể.
- pH của môi trường thường dao động từ 5 - 6 trước khi hấp khử trùng, không nên để pH quá cao, trong nuôi cấy bioreactor quy mô nhỏ hay fermentor thì pH tối ưu cần được đảm bảo bằng cách dùng thiết bị kiểm soát pH.
- Ánh sáng: Các chất thứ cấp được tạo ra trong quá trình nuôi cấy ở điều kiện tối hay có ánh sáng phụ thuộc vào từng loài thực vật và trong quá trình dinh dưỡng ở nuôi cấy in vitro là quá trình quang tự dưỡng
Mỗi loại thực vật có những điều kiện tối ưu khác nhau để sinh trưởng và sản xuất các chất hữu dụng, vì thế tùy từng trường hợp mà thay đổi các yếu tố cho phù hợp.
2.4.5. Các chất khác [4]
Trong những nghiên cứu gần đây cho thấy sử dụng các cơ chất trong quá trình nuôi cấy là cần thiết để tăng hiệu suất thu nhận các chất thứ cấp. Điều này cho
phép thực hiện các phản ứng sinh tổng hợp ra các chất thứ cấp mới mà bản thân tế bào thực vật không có. Như vậy việc sản xuất các chất thứ cấp có trong tự nhiên hay các chất mới bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật và có sự tham gia của các cơ chất là có thể thực hiện.
2.5. Các phƣơng pháp chiết xuất alkaloid [2, 3] 2.5.1. Nguyên tắc của sự chiết xuất 2.5.1. Nguyên tắc của sự chiết xuất
Dược liệu được cấu tạo bởi các tế bào thực vật. Khi cho dung môi chiết vào, dung môi sẽ đi qua các thành tế bào của dược liệu, các hoạt chất bên trong tế bào sẽ hòa tan vào dung môi, khi đó xuất hiện một quá trình thẩm thấu giữa dịch chiết trong thành tế bào và dung môi bên ngoài. Quá trình thẩm thấu này kết thúc khi có sự cân bằng về nồng độ hoạt chất của dung dịch bên trong và bên ngoài thành tế bào [2]. Có hai phương pháp cơ bản để ly trích các alkaloid ra khỏi bột cây khô, dựa vào tính bazơ đặc trưng của các alkaloid:
- Alkaloid nói chung là những chất kềm yếu, thường tồn tại trong cây dưới dạng muối của acid hữu cơ hoặc vô cơ, đôi khi ở dạng kết hợp với tanin, nên phải tán nhỏ để dược liệu dễ thấm với dịch chiết và giải phóng alkaloid khỏi muối của nó bằng những kiềm trung tính hay kiềm mạnh.
- Hầu hết các alkaloid kiềm không tan trong nước nhưng lại dễ tan trong dung môi hữu cơ ít phân cực, các muối alkaloid thường tan trong nước cồn. Mặt khác còn tùy theo tính chất của alkaloid như loại hay bay hơi hoặc không bay hơi mà dùng phương pháp chiết xuất cho thích hợp [3].
2.5.2. Phƣơng pháp ly trích bằng dung môi hữu cơ [1, 5, 8]
* Nguyên tắc: Tán nhỏ dược liệu rồi tẩm bột dược liệu với dung dịch kiềm
để chuyển đổi các alkaloid ở dạng muối thành dạng bazơ tự do, kế tiếp bột cây tẩm này được trích với dung môi hữu cơ như: benzen, eter etil, chloroform, acetat etil, nhưng chloroform là dung môi thích hợp nhất cho việc chiết hầu hết các alkaloid kiềm, dung môi này hòa tan các alkaloid bazơ vừa được giải phóng.
Cất thu hồi dung môi hữu cơ dưới áp lực hơi nước giảm rồi lắc dịch chiết cô đặc với dung dịch acid loãng (2 - 5%) thường dùng acid HCl, H2SO4…Các alkaloid
chuyển sang dạng muối tan trong nước, còn mỡ, sắc tố, sterol… ở lại dung môi hữu cơ. Gộp các dịch chiết muối lại rồi kiềm hóa để chuyển alkalod sang dạng bazơ, lắc với dung môi hữu cơ thích hợp nhiều lần để lấy kiệt alkaloid bazơ. Việc chiết bằng dung môi hữu cơ có thể dùng bình gạn hay các dụng cụ chiết chất lỏng.
Sau khi lấy riêng lớp dung môi hữu cơ chứa alkaloid bazơ người ta thường loại nước bằng muối trung tính khan nước (Na2SO4 khan) rồi cất thu hồi dung môi hoặc bốc hơi dung môi sẽ thu được cắn alkaloid thô.
2.5.3. Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nƣớc [5]
Thấm ẩm bột dược liệu bằng dung môi chiết xuất. Các alkaloid trong dược liệu sẽ chuyển sang dạng muối và tan trong dung môi trên.
Cất thu hồi dung môi hoặc bốc hơi dung môi dưới áp lực giảm, dùng ether rửa dịch chiết đậm đặc còn lại. Ở môi trường acid, ether thường hòa tan một số tạp chất chứ không hòa tan các alkaloid.
Sau khi tách lớp ether, kiềm hóa dung dịch nước rồi lấy alkaloid bazơ được giải phóng ra bằng một dung môi hữu cơ thích hợp, cất thu hồi dung môi hữu cơ rồi bốc hơi tới khô sẽ thu được cặn alkaloid thô. Phương pháp này còn gọi là STAS- OTTO.
Ngoài hai phương pháp trên người ta còn sử dụng phương pháp chiết bằng cồn đối với các alkaloid trong dược liệu tồn tại dưới dạng muối tan tốt trong cồn ở môi trường trung tính. Sau khi tán nhỏ dược liệu được đem thấm ẩm và chiết bằng cồn etylic cho tới kiệt alkaloid, quá trình tiếp theo được thực hiện tương tự như trên.
2.6. Các phƣơng pháp định tính sự hiện diện của alkaloid
Định tính alkaloid bằng thuốc thử chung
Các alkaloid cho phản ứng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid. Những phản ứng chung này chia làm hai loại: phản ứng tạo tủa và phản ứng tạo màu. Có rất nhiều thuốc thử cho phản ứng tạo màu hoặc tạo kết tủa với alkaloid. Có 3 loại thuốc thử thông dụng là: Mayer, Dragendorff, Wagner, ngoài ra còn một số thuốc thử khác để phát hiện các loại alkaloid đặc thù.
2.6.1. Phản ứng tạo tủa [8]
Thuốc thử Mayer (K2HgI4): hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60 ml nước cất và hòa tan 5 g KI trong 10ml nước cất, trộn hai dung dịch này lại và thêm nước cất đủ 100 ml. Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid loãng chứa alkaloid, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt, nhưng tủa tạo thành có thể hòa tan trở lại trong lượng thừa thuốc thử hoặc hòa tan bởi AcOH, etanol có sẵn trong dung dịch thử.
Thuốc thử Dragendorff (KBiI4): hòa tan 8,0 g Nitrat bismuth trong 25 ml HNO3 30%, và hòa tan 28 g KI, 1 ml HCl 6N trong 5 ml nước cất. Trộn hỗn hợp hai dung dịch này lại, thêm đủ 100 ml nước cất thu được dung dịch có màu đỏ cam, dùng để thử nghiệm trong ống nghiệm hay để pha thuốc phun xịt bản mỏng.
+ Định tính bằng ống nghiệm: Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendoff vào dung dịch acid loãng có chứa alkaloid, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu cam - nâu.
+ Để phun xịt lên tấm bảng mỏng: Pha dung dịch phun xịt trong bình phun xịt, nếu có akaloid sẽ cho vết màu cam - đỏ trên bản mỏng.
Thuốc thử Wagner: hòa tan 1,27 g iod và 2 g KI trong 20ml nước cất, thêm nước cất đủ 100 ml. Nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào dung dịch acid pha loãng có chứa alkaloid, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu.
2.6.2. Phản ứng tạo màu [5]
Có một số thuốc thử cho tác dụng với alkaloid cho những màu đặc biệt khác nhau do đó người ta cũng dùng phản ứng tạo màu để xác định alkaloid. Phản ứng tạo tủa cho ta biết có alkaloid hay không, còn phản ứng tạo màu cho biết có alkaloid gì trong đó. Thuốc thử tạo màu thường là những hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ hòa trong acid H2SO4 đậm đặc. Những thuốc thử tạo màu quan trọng là: acid sulfuric đậm đặc, acid Nitric đậm đặc, thuốc thử Frohde (acid sulfomolybdic), thuốc thử Marquis (sulfofocmol), thuốc thử Mandelin (acid sulfovanadic)…
Trong dịch chiết có nhiều alkaloid và còn lẫn tạp chất khác thì phản ứng lên màu không thật rõ bằng những alkaloid đã được chiết và phân lập ở dạng tinh khiết.
Do đó để kết luận được chắc chắn người ta thường dùng phản ứng màu kết hợp với phương pháp sắc kí lớp mỏng có alkaloid tinh khiết làm chất chuẩn so sánh.
2.7. Các phƣơng pháp định lƣợng alkaloid [5]
Người ta có thể định lượng toàn bộ alkaloid hay chỉ một hay vài alkaloid là hoạt chất trong một dược liệu. Có nhiều phương pháp định lượng như phương pháp cân, phương pháp đo acid, phương pháp so màu, phương pháp trung hòa, phương pháp đo bằng quang phổ tử ngoại, phương pháp cực phổ, phương pháp sinh vật… Các phương pháp định lượng alkaloid gồm hai giai đoạn chính:
+ Lấy riêng alkaloid ra khỏi dược liệu;
+ Định lượng: tùy theo tính chất của alkaloid mà lựa chọn phương pháp cho thích hợp.
2.7.1. Phƣơng pháp cân
Để định lượng alkaloid bằng phương pháp cân, cần phải chiết được alkaloid tinh khiết không lẫn tạp. Do đó phương pháp này tương đối lâu và người ta chỉ sử dụng khi những phương pháp không thuận tiện bằng.
Phạm vi sử dụng nó là những alkaloid có tính kiềm yếu. Ngoài ra, phương pháp cân còn được dùng trong trường hợp những alkaloid chưa xác định rõ cấu trúc hóa học hoặc hỗn hợp nhiều alkaloid có phân tử lượng rất khác nhau.
Khi định lượng, người ta phải chiết alkaloid tinh khiết bằng một dung môi hữu cơ, sấy tới khối lượng không đổi rồi đem cân.
Nếu hàm lượng alkaloid trong dược liệu rất thấp thì định lượng bằng phương pháp cân trực tiếp khó chính xác nên phương pháp này không được sử dụng.
2.7.2. Phƣơng pháp trung hòa
Mặc dù alkaloid chiết xuất ra được tinh chế nhưng định lượng bằng phương pháp cân thường cho sai số thừa vì các tạp chất còn bị lôi cuốn theo lẫn với cắn alkaloid. Do đó định lượng alkaloid bằng phương pháp trung hòa được dùng nhiều hơn.
Muốn định lượng bằng phương pháp này thì alkaloid phải chiết ra ở dạng kiềm. Dung dịch alkaloid kiềm phải trong vì có vẫn đục hay lẫn phần nhỏ nhũ dịch
sẽ gây ra hiện tượng hấp phụ các chất kiềm làm cho kết quả định lượng có sai số thừa. Ngoài ra, nếu có lẫn các chất kiềm như amoniac, các amin cũng như chất màu và chất béo cũng ảnh hưởng tới kết quả định lượng.
Sau khi đã có dịch chiết alkaloid kiềm tinh khiết có thể tiến hành định lượng bằng cách: lắc alkaloid trong dung môi hữu cơ có lượng acid chuẩn độ dư, sau đó định lượng alkaloid thừa bằng kiềm tương ứng, hoặc làm bốc hơi dung môi hữu cơ, cắn alkaloid còn lại được định lượng trực tiếp hay gián tiếp bằng acid chuẩn độ. Người ta thường dùng HCl hay H2SO4 có nồng độ 0,01 - 0,1N để chuẩn độ, chỉ thị màu dùng trong định lượng phần lớn là methyl đỏ vì hầu hết muối alkaloid đều làm chuyển màu chỉ thị này trong khoảng pH = 4,2 - 6,3.
2.7.3. Định lƣợng alkaloid trong môi trƣờng khan
Những alkaloid có tính kiềm yếu thì chuẩn độ trong môi trường dung dịch nước không chính xác vì muối tạo ra khi trung hòa sẽ thủy phân mạnh nên khó quan sát vùng chuyển màu của chỉ thị. Tuy vậy nếu hòa tan alkaloid vào trong dung môi không phải là nước (gọi là môi trường khan) thì người ta có thể định lượng được những alkaloid có tính kiềm yếu này. Thường dùng acid percloric 0,1N để định lượng và chỉ thị màu là gentian tím.
2.7.4. Phƣơng pháp so màu
Phương pháp so màu chỉ cần một lượng nhỏ alkaloid, lại có độ nhạy và có kết quả nhanh do đó cũng là phương pháp hay dùng để định lượng alkaloid. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào phản ứng tạo màu của alkaloid, dùng dung dịch có màu để định lượng.
Những alkaloid không thể tạo thành dung dịch có màu để định lượng trực tiếp người ta cho alkaloid tác dụng với thuốc thử tạo tủa có màu, sau đó tách riêng tủa và hòa tan trong dung môi thích hợp sẽ được dung dịch có màu để định lượng alkaloid.
2.7.5. Các phƣơng pháp định lƣợng alkaloid hiện đại 2.7.5.1. Hệ thống sắc kí lỏng cao áp (HPLC)
Nguyên lí hoạt động: phương pháp này dựa theo tính chất hấp thụ, sự
phân bố hay trao đổi ion của chất tan (chất phân tích) với pha tĩnh ở trong cột để tách các chất. Vì dùng hạt pha tĩnh kích thước rất nhỏ (3 - 10 µm) để tăng số đĩa lí thuyết cho cột và để cân bằng giữa pha tĩnh và pha động được thiết lập nhanh, nên phải dùng bơm hoặc khí ép có áp suất cao để đẩy pha động đi được nhanh. Cột tách phải bằng thép không gỉ để chịu được áp suất cao (400 - 600 atm) và có đường kính 1 - 4 mm. Thể tích dung dịch mẫu khoảng vài đến vài chục µl (được tiêm vào phía trên cột). Nếu dùng máy tự ghi sẽ thu được sắc kí đồ với một dãy các pic; mỗi pic ứng với một chất [31].
Ƣu điểm
- Kĩ thuật phân tích hiện đại, hiện nay được sử dụng khá phổ biến trong các lĩnh vực nghiên cứu, kiểm nghiệm, tách các chế phẩm đa thành phần.
- Cho kết quả nhanh, tốt cả về mặt định tính lẫn định lượng.
2.7.5.2. Hệ thống điện di mao quản (CE) [13]
Nguyên lý hoạt động: Phương pháp phân tích này dựa theo nguyên tắc di chuyển của những chất tích điện trong một điện trường nhờ vào hai nguyên tắc cơ bản sau: quá trình điện di (electromigration) và quá trình điện thẩm (electroosmose). + Sự dịch chuyển điện di là sự di chuyển của các cấu tử mang điện trong dung dịch về điện cực ngược dấu.
+ Dòng điện thẩm biểu diễn một dòng chất điện ly lớn gây nên bởi thành mao quản bên trong được tích điện và thế áp đặt. Khi đặt điện thế các cation trong dung dịch điện ly gần thành mao quản di chuyển về phía catod, kéo dung dịch điện ly đi theo chúng. Điều này tạo thành một dòng điện thẩm thấu hướng về phía catod
Mẫu có thể được bơm vào trong hệ thống nhờ áp suất hoặc điện áp. Dưới tác dụng của điện áp cao, các cấu tử đi qua một cửa sổ của mao quản, một detector UV – DAD chọn lọc – bước sóng phát hiện chúng và truyền một tín hiệu điện tỉ lệ với độ hấp thu của mẫu đến máy ghi, tích phân kế hay máy tính. Các tín hiệu này sẽ
được vẽ dưới dạng được sắc kí đồ với một dãy các pic; mỗi pic ứng với một chất. Kĩ thuật điện di mao quản được sử dụng để phân tích nhiều loại mẫu : acid amin, protein, đoạn DNA, acid nucleic và đặc biệt thích hợp cho việc phân tích các chất quý giá có hoạt tính sinh học.
Ƣu điểm
Lượng mẫu đòi hỏi rất bé 5 - 30 µl, với thể tích bơm mẫu thực sự chỉ 10 - 50 nl, ngưỡng phát hiện thấp.
Thời gian phân tích mẫu ít hơn so với các phương pháp truyền thống khác,