3.2.2.1. Thiết bị
Tủ sấy, máy hấp tiệt trùng (autoclave), tủ lạnh, cân điện tử, máy lắc (vortex), lò vi sóng, kính hiển vi, tủ ấm, …
3.2.2.2. Dụng cụ
Lam, đèn cồn, que cấy, que trang, đũa thuỷ tinh, ống nghiệm, đĩa petri, micropipete, giá ống nghiệm, …
Tất cả các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong thí nghiệm đều phải được rửa sạch, bao gói và hấp tiệt trùng ở 1210C /15 phút.
3.3. Nội dung nghiên cứu
Phân lập loài vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất
Khảo sát khả năng sinh hai loại enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn và các yếu tố ảnh hưởng.
Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học.
Khảo sát sự thay đổi hoạt độ của enzyme chế phẩm trong thời gian bảo quản.
3.4. Phƣơng pháp thực hiện đề tài
3.4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 3.4.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn 3.4.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn
Dùng muỗng gạt nhẹ, bỏ phần lớp đất mặt khoảng 2 - 3cm, lấy lớp đất ở dưới. Cân 10 g mẫu đất cho vào bình tam giác có chứa 90 ml nước muối sinh lí vô trùng và lắc đều, được nồng độ pha loãng 10-1.
3.4.1.2. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis
Chuẩn bị 4 ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lí vô trùng, đánh số thứ tự từ 1 đến 4. Dùng micropipete hút 1 ml từ bình tam giác chứa mẫu đất phân lập có nồng độ pha loãng 10-1
cho vào ống nghiệm 1 và lắc đều bằng máy vortex, được nồng độ pha loãng 10-2, tiếp tục làm cho đến ống nghiệm cuối cùng. Tiếp theo chọn các ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10-3 ,10-4, 10-5 dùng micropipete hút 0,1 ml từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA (mỗi nồng độ lặp lại 2 lần) và trang đều bằng que trang vô trùng, sau đó cho những đĩa TSA này vào tủ ấm ủ ở 370C/24h. Sau đó quan sát khuẩn lạc hình thành trên đĩa, chọn những khuẩn lạc nghi ngờ là của vi khuẩn Bacillus subtilis, dùng que cấy vòng bắt và cấy giữ giống lại trên môi trường TSA nghiêng.
Đồng nhất và pha loãng mẫu: 1 g mẫu + 9 ml dd NaCl 90/00
Lần lượt pha loãng được các nồng độ tiếp theo
ủ ở 370C/ 24h
Sơ đồ 3.1: Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 3.4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập đƣợc
Quan sát hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi.
Lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ ống TSA làm tiêu bản nhuộm Gram để quan sát dưới kính hiển vi, độ phóng đại 1000 lần. Các chỉ tiêu quan sát: sự bắt màu, hình dạng, cách sắp xếp của tế bào vi khuẩn, có hay không có bào tử. Sau khi quan sát dưới kính hiển vi nếu thấy tiêu bản vi khuẩn phù hợp với những đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis (như : là trực khuẩn, hai đầu tròn, G+, bắt màu tím, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào) thì tiếp tục thử các phản ứng sinh hoá để khẳng định.
Khảo sát các phản ứng sinh hoá của vi khuẩn phân lập được.
Mẫu đất
Dd pha loãng mẫu 10-1
Hút từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA
Chọn khuẩn lạc diển hình, nhuộm Gram và thử các phản ứng sinh hoá
Thử phản ứng sinh hóa
Sơ đồ 3.2: Định danh vi khuẩn Bacillus subtilis(Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006)
3.4.2. Các thí nghiệm về vi khuẩn Bacillus subtilis
3.4.2.1. Ảnh hƣởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis
Mục đích: xác định thời gian và chế độ nào phù hợp nhất.
Bảng 3. 1: Bố trí thí nghiệm 1
Chế độ sục Thời khí gian
Lô1: sục khí liên tục Lô 2: không sục khí Hoạt độ amylase Hoạt độ protease Hoạt độ amylase Hoạt độ protease 24 giờ 48 giờ Cách làm:
Lấy vi khuẩn Bacillus subtilis từ các ống giống vào các ống nghiệm chứa 4 - 5 ml nước muối sinh lí đã hấp tiệt trùng (1210C/15phút), sau đó đo độ đục để cân bằng số lượng vi khuẩn cho vào các lô.
Sau đó chuẩn bị 2 bình (cho một ống giống), mỗi bình chứa 150 ml môi trường TSB, cấy giống Bacillus subtilis với tỉ lệ 3%. Cho vòi sục khí vào bình với
Chủng vi khuẩn thuần đã quan sát dưới kính hiển vi
Hoạt tính catalase (+), Lecithinase (-), Nitrat (+), Voges-Proskauer (+), Citrat (+), Maltose (-).
thời gian và chế độ sục khí khác nhau: bình 1 sục khí liên tục, bình 2 không sục khí. Lấy mẫu vào các thời điểm 24h, 48h. Thí nghiệm được thực hiện trong 48 giờ và ở nhiệt độ phòng, sau đó đọc kết quả.
Kiểm tra hoạt độ enzyme vào các thời điểm 24h, 48h ở 2 chế độ nuôi cấy khác nhau.
Thí nghiệm được lặp lại 2 lần.
Từ đó chọn được chế độ nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis thích hợp, lựa chọn 4 chủng cho kết quả tốt để tiếp tục khảo sát các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.2.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn
Bacillus subtilis
Mục đích: xác định môi trường nuôi cấy thích hợp với các chủng đã chọn ở thí nghiệm 1.
Cách làm:
Cấy vi khuẩn từ các ống giống vào các ống nghiệm chứa 4 - 5 ml nước muối sinh lí đã hấp khử trùng, đem đo độ đục.
Sau đó chuyển vi khuẩn từ các ống nghiệm vào 4 loại môi trường thử nghiệm: Rỉ đường + 2% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột, TSB + 1% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton với các điều kiện khảo sát:
Nhiệt độ: nhiệt độ phòng Tỉ lệ giống 3%
pH = 6
Thời gian nuôi cấy và chế độ được chọn theo kết quả thí nghiệm 1. Sau đó tiến hành kiểm tra hoạt độ enzyme amylase và protease. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần.
Phương pháp kiểm tra hoạt độ enzyme:
Kiểm tra hoạt độ enzyme amylase bằng phương pháp Wolhgemuth. Kiểm tra hoạt độ enzyme protease bằng phương pháp Gross + Fluld.
Sau khi kiểm tra hoạt độ enzyme trên từng loại môi trường, tiến hành chọn môi trường nuôi cấy thích hợp để làm thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 3. 2: Bố trí thí nghiệm 2
Môi trƣờng Hoạt độ enzyme amylase Hoạt độ enzyme protease Lần 1 Lần 2 Lần 1 Lần 2 Rỉ đường + 2% tinh bột Rỉ đường + 1% tinh bột Rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton TSB + 1% tinh bột
3.4.2.3. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis của các chủng Bacillus subtilis
Mục đích: xác định pH và thời gian nuôi cấy thích hợp với các chủng đã chọn ở thí nghiệm 1.
Cách làm:
Cấy vi khuẩn từ các ống giống vào các ống nghiệm chứa 4 - 5 ml nước muối sinh lí đã hấp khử trùng, đem đo độ đục.
Sau đó chuyển vi khuẩn từ các ống nghiệm vào môi trường đã chọn ở thí nghiệm 2 ở các pH và thời gian khác nhau với tỉ lệ 3% và nuôi cấy ở chế độ đã chọn ở thí nghiệm 1.
Kiểm tra hoạt độ amylase và protease (thí nghiệm được lập lại 2 lần).
Bảng 3. 3: Bố trí thí nghiệm 3
pH 6,0 7,0
Hoạt độ enzyme Thời gian
amylase protease amylase protease
24h 48h
Từ khảo sát trên, chọn mức pH, thời gian thích hợp mà các chủng Bacillus subtilis cho hoạt độ enzyme tốt nhất.
3.4.3. Thử nghiệm thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm từ
Bacillus subtilis
3.4.3.1. Quy trình thực hiện
3.4.3.2. Kiểm tra chế phẩm trong thời gian bảo quản
Chế phẩm được kiểm tra hoạt độ enzyme ở các khoảng thời gian: 10 ngày, 20 ngày, 30 ngày theo hai chế độ bảo quản: 4 - 100C và nhiệt độ phòng.
Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphic 7.0.
Sấy khô chế phẩm ở nhiệt độ 40 – 500C Các giống vi khuẩn đã chọn ở thí nghiệm 1
Môi trường nhân giống: môi trường TSB với điều kiện nuôi cấy đã chọn
Môi trường sản xuất: cám gạo
Kiểm tra hoạt độ enzyme protease và amylase
Thời gian 48h, nhiệt độ 370C
Thu hoạch chế phẩm
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis
4.1.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis
Sau khi pha loãng mẫu và cấy trang trên môi trường TSA đĩa, ủ 24 giờ, quan sát và bắt giữ giống những khuẩn lạc có đặc điểm như hình 4.1: khuẩn lạc có bề mặt khô, mọc lan trên mặt thạch, dạng tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm màu, màu vàng xám. Tiếp tục làm tiêu bản nhuộm Gram từng chủng vi khuẩn phân lập và quan sát dưới kính hiển vi (độ phóng đại x 1000 lần) để khảo sát đặc điểm hình thái.
Hình 4. 1. Đặc điểm khuẩn lạc
Bacillus subtilis
4.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis
Nhuộm Gram tiêu bản vi khuẩn và quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần, chúng tôi nhận thấy các chủng vi khuẩn được nghi ngờ có hình thái giống với Bacillus subtilis, là những trực khuẩn bắt màu Gram dương, ngắn, nhỏ, hai đầu tròn, kích thước 0,5 - 0,8 m x 1,5 - 3 m, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn, có bào tử và bào tử nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng.
Hình 4. 2: Đặc điểm hình thái vi khuẩn
Bacillus subtilis
(www.biol.pmf.hr/.../odg-slike/odg451.jpg)
4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn nghi ngờ là
Bacillus subtilis
Các chủng phân lập có đặc điểm hình thái phù hợp với Bacillus subtilis
được chọn làm một số phản ứng sinh hóa để khẳng định. Kết quả được trình bày ở bảng 4.1.
Sau khi thử phản ứng sinh hóa của 21 chủng nghi ngờ, chúng tôi xác định được 10 chủng là vi khuẩn Bacillus subtilis. Tiếp tục chúng tôi tiến hành các thí nghiệm khảo sát khả năng sinh enzyme amylase và protease trong những môi trường và điều kiện nuôi cấy khác nhau của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis
Bảng 4. 1: Kết quả thử phản ứng sinh hóa của các chủng phân lập Ghi chú: (+) là phản ứng dương tính (-) là phản ứng âm tính Chủng phân lập Các phản ứng sinh hóa
Catalase Lecithinase Nitrate Citrate MR - VP Maltose
1 + + + + + 2 + + + + + 3 + + + + + 4 + + + + + 5 + + + + + 6 + + + + + 7 + + + + + 8 + + + + + 9 + + + + + 10 + + + + + 11 + + + + 12 + + + + 13 + + + + 14 + + + + 15 + + + + 16 + + + + 17 + + + + 18 + + + + 19 + + + 20 + + + 21 + + +
4.2. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme amylase và protease của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập đƣợc
Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Các chủng vi khuẩn phân lập được nuôi cấy trong môi trường TSB ở hai chế độ sục khí và không sục khí với thời gian khảo sát là 24 giờ, 48 giờ, nhiệt độ phòng, pH = 7, chúng tôi tiến hành theo dõi chỉ tiêu về khả năng sinh enzyme amylase và protease với kết quả như sau:
Bảng 4.2: Kết quả thí nghiệm 1 (Bảng phụ lục 1 và 2) Chế độ sục khí Thời gian Lô 1: sục khí liên tục (n = 18) Lô 2: không sục khí (n = 18) Hoạt độ amylase (W0/ml) Hoạt độ protease (Hdp/ml) Hoạt độ amylase (W0/ml) Hoạt độ protease (Hdp/ml) 24 giờ 39,11 32,89 14,44 5,44 48 giờ 47,11 40 25,78 8 Hoạt độ trung bình 43,11 36,45 20,11 6,72
Qua kết quả được trình bày ở bảng 4.2 cho thấy hoạt độ trung bình của hai loại enzyme trong 1 ml canh khuẩn ở chế độ sục khí liên tục cao hơn hoạt độ trung bình của hai loại enzyme ở chế độ không sục khí.
Kết quả xử lý thống kê cho thấy có sự khác biệt ở hai chế độ nuôi cấy và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê ở cả hai loại enzyme (với P < 0,05) (Phụ lục A). Như vậy cho thấy với chế độ sục khí do cung cấp oxy nhiều nên giúp cho vi khuẩn phát triển nhanh và sản sinh ra nhiều enzyme hơn so với chế độ không sục khí (vì Bacillus sinh sản và phát triển tốt).
Kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy có sự khác biệt về hoạt độ của hai loại enzyme giữa hai khoảng thời gian nuôi cấy (24 giờ, 48 giờ) (với P < 0,05) (Phụ lục A). Theo kết quả của chúng tôi khi nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis ở 48 giờ với chế độ sục khí liên tục sẽ cho hoạt độ enzyme cao hơn so với điều kiện nuôi cấy sục khí liên tục trong 24 giờ. Như vậy chứng tỏ khi vi khuẩn được cung cấp oxy càng nhiều thì chúng phát triển càng tốt và sinh càng nhiều enzyme.
Cũng theo kết quả thống kê: có sự khác biệt về mặt thống kê giữa 9 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được nuôi cấy (cụ thể có sự khác biệt giữa các chủng: chủng 2 – 5, chủng 2 – 6, chủng 2 – 8, chủng 1 - 9, chủng 4 - 9,...).
Tuy nhiên giữa hai chế độ sục khí và không sục khí thì hoạt độ enzyme trong cùng một chủng không đồng nhất, có thể ở điều kiện cung cấp oxy một số chủng này phát triển tốt hơn và ở chế độ không cung cấp oxy một số chủng khác lại phát triển tốt hơn. Điều này cho thấy có sự khác biệt về đặc điểm sinh học giữa các chủng.
Từ các kết quả có được như trên, chúng tôi quyết định chọn chế độ sục khí liên tục trong thời gian 48 giờ và chọn 4 chủng: 2, 7, 9, 10 trong 9 chủng phân lập được để tiếp tục khảo sát hoạt độ của hai loại enzyme trong các môi trường nuôi cấy khác nhau ở thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 4. 3: Kết quả hoạt độ enzyme trung bình của 9 chủng vi khuẩn thí nghiệm Chủng vi khuẩn Hoạt độ enzyme amylase (W0/ml) Hoạt độ enzyme protease (Hdp/ml) Hoạt độ trung bình của 2 loại enzyme 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ amylase protease
1 40 48 16 32 44 24 2 64 56 24 32 60 28 4 40 48 20 32 44 26 5 32 48 20 32 40 26 6 32 40 24 40 36 32 7 32 48 56 48 40 52 8 32 40 32 32 36 32 9 48 48 64 56 48 60 10 32 48 40 56 40 48
4.3. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis
Chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis trên 4 loại môi trường: rỉ đường + 2% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% peptone, TSB + 1% tinh bột với 4 chủng đã chọn và điều kiện nuôi cấy là: nhiệt độ phòng, tỉ lệ cấy giống là 3%, sục khí liên tục trong 48 giờ (mỗi chủng 4 loại môi trường) (thí nghiệm lặp lại 2 lần). Kết quả được trình bày qua bảng 4.4.
Bảng 4. 4. Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn. Môi trường Hoạt độ enzyme amylase (W0/ml) Hoạt độ enzyme protease (Hdp/ml) Rỉ đường + 2% tinh bột (1) (n = 8) 26 30 Rỉ đường + 1% tinh bột (2) (n = 8) 18,5 22 Rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton (3) (n = 8) 20 32 TSB + 1% tinh bột (4) (n = 8) 14,5 20
Qua kết quả khảo sát hoạt độ hai loại enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, chúng tôi nhận thấy rằng môi trường rỉ đường + 2% tinh bột có hoạt độ enzyme trung bình cao hơn hoạt độ enzyme trung bình trên các môi trường rỉ đường + 1% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% peptone, TSB + 1% tinh bột.
Kết quả xử lý thống kê cho thấy có sự khác biệt ở 4 loại môi trường trên (cụ thể là có sự khác biệt giữa các môi trường: 1 - 2, 1 - 4, 2 - 3, 3 - 4) (Phụ lục B) và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (với P < 0,05) (Phụ lục B).
Theo Nguyễn Đức Duy Anh, (2005): trong 5 loại môi trường nhân giống cấp 1 (Edward, Fragie, Nomura, pepton - gelatin, rỉ đường + 2% tinh bột) thì môi trường rỉ đường + 2% tinh bột cũng cho kết quả tốt nhất nhưng hoạt độ của cả hai loại enzyme đều rất cao (amylase: 256 W0/ml, protease: 128 Hdp/ml) so với hoạt độ enzyme của môi trường rỉ đường + 2% tinh bột trong thí nghiệm này (amylase: 26 W0/ml, protease: 30 Hdp/ml). Sự chênh lệch hoạt độ enzyme trong cùng một loại môi trường này có thể là do sử dụng hai nguồn vi khuẩn khác nhau, lượng giống cho vào với tỉ lệ khác nhau.
Từ kết quả trên chúng tôi quyết định chọn môi trường rỉ đường + 2% tinh bột để tiến hành khảo sát ở thí nghiệm tiếp theo.
4.4. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis các chủng Bacillus subtilis
Dựa trên các kết quả có được ở các thí nghiệm trên chúng tôi tiến hành