2.7.2.1. DNA khuôn
DNA khuôn chứa trình tự cần khuếch đại có vai trò rất quan trọng, ảnh hƣởng rõ rệt đến hiệu quả PCR. Phản ứng PCR diễn ra tối ƣu với các DNA khuôn hoàn toàn tinh sạch.
2.7.2.2. Dung dịch đệm (buffer)
Dung dịch đệm có tác dụng cung cấp lực ion cần thiết cho phản ứng xảy ra. Nồng độ các chất, pH của dung dịch đệm tùy thuộc vào nguồn enzyme DNA polymerase đƣợc dùng. Các thành phần của một dung dịch đệm điển hình gồm: KCl, gelatin và Tris - HCl (pH 8,5 ở nhiệt độ phòng).
2.7.2.3. MgCl2
Nồng độ Mg2+ là yếu tố ảnh hƣởng mạnh đến phản ứng PCR. Cụ thể, Mg2+ làm tăng hoạt động của DNA polymerase, tăng Tm của DNA. Nồng độ Mg2+
trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng thƣờng biến thiên trong khoảng từ 0,5 - 5 mM. Nồng độ MgCl2 từ 1,5 – 2 mM thƣờng đƣợc xem là tối ƣu.
2.7.2.4. Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs)
Là nguyên liệu cần thiết cho phản ứng tổng hợp DNA. Hỗn hợp dNTP gồm 4 loại: dATP, dTTP, dCTP, dGTP và thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ 20 – 200 µM mỗi nucleotide. Điều quan trọng là phải giữ cho nồng độ của cả 4 loại dNTP bằng nhau vì sự mất cân bằng thành phần các nucleotide sẽ làm tăng lỗi sao chép của DNA polymerase.
2.7.2.5. Primer
Primer là một oligonucleotide thƣờng có chiều dài từ 20 – 30 nucleotide. Đây là yếu tố ảnh hƣởng trực tiếp đến hiệu quả cũng nhƣ độ chuyên biệt của phản ứng PCR.
2.7.2.6. Taq – polymerase
Là một DNA polymerase chịu nhiệt, đƣợc tách chiết từ vi khuẩn suối nƣớc nóng
Thermus aquaticus. Taq - polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính của phản ứng PCR và hoạt động tối ƣu ở 68 - 72o
Nồng độ enzyme Taq polymerase đƣợc sử dụng thông thƣờng là 0,5 - 5 unit/100μl dung dịch phản ứng. Nếu nồng độ Taq quá cao có thể tạo ra những sản phẩm không chuyên biệt làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq quá thấp, phản ứng sẽ không có đủ lƣợng enzyme cần thiết để tạo ra sản phẩm PCR theo mong muốn
2.7.2.7. Nhiệt độ bắt cặp
Phản ứng PCR rất nhạy cảm với nhiệt độ, đặc biệt là với nhiệt độ bắt cặp của mồi. Vì thế bất cứ sự thay đổi nào của yếu tố này cũng có thể ảnh hƣớng mạnh đến năng suất và độ chuyên biệt. Thông thƣờng, số base của primer càng ít, nhiệt độ này càng thấp và ngƣợc lại.
2.7.2.8. Số chu kỳ của phản ứng PCR
Số chu kỳ cho một phản ứng tùy thuộc vào số lƣợng bản sao ban đầu của mẫu. Ví dụ nếu lƣợng bản mẫu ban đầu là 105 thì cần 25 – 30 chu kỳ, nếu lƣợng bản mẫu là 102
– 103 thì số lƣợng chu kỳ là 35 – 40.