- Đôi nét về phản ứng chuỗi PCR:
Các thông số kỹ thuật:
Bất kỳ một phản ứng PCR nào cũng bắt đầu bằng việc tách ADN làm sợi khuôn. Nói chung, theo lý thuyết chỉ cần một sợi khuôn cũng đủ cho phản ứng tạo ra sản phẩm nhưng trong thực tế cần khoảng 10-100 ng/phản ứng. Đôi khi chuẩn bị ADN theo phương pháp đơn giản không cần tinh sạch cũng phù hợp cho phản ứng PCR. Tuy nhiên, điều quan trọng là tránh sự có mặt của EDTA (acide éthylène-diamine-tétraacétique) hoặc đệm phosphat vì kết quả sẽ làm giảm Mg++ (do EDTA hoặc tạo thành muối Mg3(PO4)2 khi nhiệt độ cao). Phản ứng PCR có thể nhân được đoạn gene dài 10 Kb nhưng trong thực tế thường dùng để nhân các đoạn có kích thước ngắn hơn (<2 Kb). Có thể tham khảo các thông số thành phần phản ứng PCR trong bảng dưới đây.
Bảng 1.8. Thành phần phản ứng PCR. Thành phần Số lượng ADN khuôn 10-100 ng dNTP (mỗi loại) 200 mM Mồi xuôi 0.1 – 1.0 mM Mồi ngược 0.1 – 1.0 mM Taq polymerase 1 U KCL 50 mM Tris HCL (pH 8.4) tại 25oC 10 mM MgCl2 2.85 mM Gelatin 100 mg/l Nonidet-40 0.05%
Số chu kỳ cho phản ứng tạo sản phẩm đặc hiệu từ 20-30 chu kỳ. Điều chú ý là các mồi cho phản ứng phải có nhiệt độ bắt cặp với ADN đích gần nhau, có trình tự không bổ sung nhau để tránh bắt cặp với nhau. Trình tự đầu 3’ của các mồi cũng phải khác với trình tự vùng trung tâm của sản phẩm để tránh tạo thành hiện tượng kẹp tóc. Nói chung, ngày nay người ta có thể tối ưu hoá việc chọn mồi nhờ sự trợ giúp của các chương trình máy tính.
Đôi khi cũng xuất hiện hiện tượng nhân sản phẩm PCR không đặc hiệu, điều này thường hay xuất hiện khi dùng các cặp mồi suy biến từ chuỗi acid amin. Tuy nhiên trong hầu hết các trường hợp này thì việc thay đổi điều kiện phản ứng có thể hạn chế được các sản phẩm không mong muốn. Các thành phần như nhiệt độ, nồng độ Mg++ và enzym có ảnh hưởng lớn đến tính đặc hiệu. Sự có mặt của nonidet-40 có tác dụng tăng hiệu suất của phản ứng.
Việc ứng dụng kỹ thuật RFLP với sản phẩm PCR có thể là cách nhanh chóng để tìm sự khác biệt đối với các gene khác nhau. Với cách này yêu cầu sản phẩm PCR phải sạch và đồng nhất. Theo cách này trình tự có thể được thực hiện như sau: Sau khi điện di kiểm tra độ sạch của sản phẩm PCR, tiến hành kết tủa với ethanol. Kết tủa được hoà với đệm thích hợp và sau đó được xử lý với enzym cắt hạn chế thích hợp. Kiểm tra kết quả thông thường trên gel agarose, trong một số trường hợp có thể trên gel polyacylamid để thu được độ phân giải cao hơn. Chú ý rằng thông thường hoạt tính enzym giảm 5% sau mỗi chu kỳ nhiệt. Như vậy có thể ước lượng 50% hiệu quả khuyếch đại mất đi trong toàn bộ quá trình phản ứng.