RAPD dùng trong thí nghiệm này đƣợc thực hiện theo qui trình nhiệt do Ducan và các cộng sự đề xuất năm 1993. Chu trình nhiệt này có 45 chu kỳ và bao gồm: quá trình biến tính 940C trong 1 phút, bắt cặp: 360C trong 1 phút và 720
C trong 2 phút. Nhằm tiết kiệm thời gian mà vẫn có đƣợc kết quả tốt, chúng tôi đã tiến hành khảo sát số chu kì phản ứng của quy trình nhiệt lần lƣợt là 35, 40 và 45 chu kì. Kết quả khảo sát đƣợc trình bày ở hình 4.3.
Hình 4.3. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của dòng nấm L651 với primer OPL-08 ở các số chu kì khác nhau của quy trình nhiệt. 1: 35 chu kì, 2: 45 chu kì, 3: 40
chu kì
Hình 4.3 cho thấy, khi phản ứng RAPD thực hiện ở 35 chu kì, các băng có xuất hiện nhƣng rất mờ. Giữa 40 và 45 chu kì, sản phẩm phản ứng hầu nhƣ không có khác biệt gì nhiều về chất lƣợng sản phẩm. Các băng nhiều và rõ. Do đó, qui trình nhiệt có 40 chu kì đƣợc chọn để thực hiện các thử nghiệm tiếp theo.
4.2.3. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ hoá chất lên phản ứng RAPD:
Để phản ứng RAPD cho phản ứng tối ƣu nhất thì cần có sự tƣơng thích giữa các thành phần hoá chất trong phản ứng. Vì thế, với mục đích tối ƣu hoá phản ứng chúng tôi đã thay đổi lần lƣợt nồng độ của các chất trong phản ứng RAPD. Trƣớc hết chúng tôi đã khảo sát kết hợp 5 nồng độ của MgCl2 và primer. Các kết quả đƣợc thể hiện trong hình 4.4:
Hình 4.4. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của dòng nấm L66 và primer OPL-05 với các nồng độ MgCl2 và primer khác nhau. Lane 1-3: MgCl2: 3 mM, 4 mM,
4,5 mM, primer: 0,3 mM, lane 4-5: MgCl2: 4 mM, primer: 0,4mM, 0,5 mM Qua hình 4.4 cho thấy nghiệm thức thứ 5 (MgCl2: 4 mM, primer: 0,2 mM cho kết quả tốt nhất. Số băng nhiều nhiều và rõ. Đối với nghiệm thức 1 và 2 nồng độ MgCl2 (3 mM và 3.5 mM)quá thấp, làm giảm số băng sản phẩm điện di. Nồng độ primer cao cũng làm ức chế số lƣợng sản phẩm. Ở nghiệm thức 3,4 và 5 cùng
nồng độ MgCl2 (4 mM) nhƣng với nồng độ primer cao hơn (0,3 mM và 0,4 mM), số băng sản phẩm của nghiệm thức 3 và 4 ít hơn hẳn so với nghiệm thức 5. Nhƣ vậy, qua thí nghiệm 2.1, chúng tôi đã chọn nghiệm thức 5 với nồng độ của MgCl2 (4 mM) và primer (0,2 mM) khá tốt cho phản ứng RAPD.(bảng 4.1).
Hình 4.5. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của dòng nấm L 66 và primer OPL-05 với các nồng độ Taq và DNA mẫu khác nhau. Lane 1-3: Taq: 0,2 µl, 0,25µl,
0,3µl, DNA mẫu: 2µl, lane 4: taq: 0,25µl, DNA mẫu: 1µl
Sau khi xác định đƣợc nồng độ của MgCl2 và primer cho RAPD, chúng tôi đã tiếp tục khảo sát 4 nồng độ khác nhau của Taq polymerase kết hợp với DNA mẫu. Kết quả đƣợc thể hiện qua hình 4.5. Thí nghiệm khảo sát nồng độ Taq và DNA mẫu (thí nghiệm 2.2) đƣợc thực hiện với nồng độ MgCl2 (4 mM) và primer
(0,2 mM) đã đƣợc xác định trƣớc đó. Ở thí nghiệm này, nghiệm thức 4 (Taq: 0,25µl và DNA mẫu: 1µl) cho kết quả tốt nhất. Ở nghiệm thức 1, lƣợng Taq ít (0,2 µl) nên không cho sản phẩm. Lƣợng Taq quá cao cũng ức chế phản ứng, tạo ít băng sản phẩm. Ngoài ra, lƣợng DNA mẫu cao (2 µl) cũng là 1 nguyên nhân ức chế phản ứng.
Nhƣ vậy, nghiệm thức 4 đƣợc lựa chọn để thực hiện phản ứng RAPD của các dòng phân lập nấm R. solani trong khoá luận này.
Sau khi thực hiện các thí nghiệm đã thu đƣợc thành phần hoá chất cho phản ứng RAPD khá tốt. Thành phần hoá chất này đƣợc trình bày ở bảng 4.1 và đƣợc sử dụng để khảo sát sự đa dạng di truyền của các dòng phân lập nấm R. solani.
Bảng 4.1. Thành phần hoá chất cho phản ứng RAPD đƣợc sử dụng để khảo sát sự đa dạng di truyền của R. solani
Hoá chất Nồng độ gốc Thể tích sử dụng Nồng độ CUỐI Buffer MgCl2 dNTP’S primer Taq polymerase DNA mẫu Nƣớc cất 5X 25 mM 10 mM 10 mM 5U 20-50 ng 5 µl 4 µl 1 µl 0,5 µl 0.25 µl 1µl 13,25 µl 1X 4 mM 0,4 mM 0,2 mM 1,25 U 20- 50 ng Tổng 25 µl
4.3. Phản ứng RAPD của các dòng phân lập nấm R. solani
Sự đa dạng di truyền của các dòng phân lập nấm R.solani đƣợc khảo sát bằng phản ứng RAPD với 3 primer OPM-13, OPL-05, OPL-08. Sản phẩm của phản ứng đƣợc điện di trên gel agarose 2%. Các đoạn DNA có cùng trọng lƣợng phân tử sẽ di chuyển đến cùng một vị trí trên gel. Sự khác biệt giữa các dòng nấm đƣợc thể hiện bằng sự khác biệt về số lƣợng và vị trí của các băng DNA trên gel
Hình 4.6. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của 17 dòng phân lập nấm R.solani với primer OPM-13. 1: L31, 2: L38, 3: L50, 4:L54, 5: L55, 6: L56, 7: L58, 8: L59, 9:
L61, 10:L63, 11: L64, 12: L651, 13: L66, 14: L72, 15: L75, 16 : L781, 17: L79
Hình 4.7. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của 17 dòng nấm R.solani với primer OPL - 05. 1: L31, 2: L38, 3: L50, 4:L54, 5: L55, 6: L56, 7:ladder, 8: L58, 9: L59, 10: L61, 11: L63, 12: L64, 13: L651, 14: L66, 15: L72, 16 : L75, 17: L781, 18: L79
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Hình 4.8. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của 17 dòng nấm R.solani với primer OPL - 08. 1: L31, 2: L38, 3: L50, 4:L54, 5: L55, 6: L56, 7: L58, 8: L59, 9: ladder, 10: L61, 11: L63, 12: L64, 13: L651, 14: L66, 15: L72, 16 : L75, 17: L781, 18: L79
Hình 4.6, 4.7 và 4.8 cho thấy cả 3 primer đều bắt cặp và cho ra những sản phẩm khá tốt với DNA của các dòng nấm R.solani. Với 2 primer OPL-08 và OPL- 05, sản phẩm RAPD tạo ra nhiều băng và đa số là các băng đa hình và chỉ có một băng đồng hình (primer OPM-13). Các băng này có kích thƣớc từ 100 đến 2000 bp. Đối với primer OPM-13, số băng không nhiều và nhỏ ( 100 đến 800 bp) nhƣng hầu hết là các băng đa hình.
Qua hình 4.6, 4.7, và 4.8 ngoài các băng rõ còn có một số băng bị mờ hoặc hình điện di bị nhoè không rõ băng. Điều này có thể là do quá trình điện di không tốt làm cho băng tách không rõ. Cũng có thể là do điện cực bị cong. Ngoài ra, các băng mờ còn có thể do thao tác PCR không tốt hoặc qui trình chƣa phù hợp làm giảm lƣợng sản phẩm. Ngoài ra, sự tƣơng quan giữa nồng độ của các chất trong hỗn hợp phản ứng chƣa thật sự phù hợp hoàn toàn với nhau và với từng primer khác nhau cũng là nguyên nhân quan trọng làm sản phẩm RAPD không đƣợc tốt.
Primer OPM-13 chỉ cho tối đa 5 băng sản phẩm (hình 4.6). Đây là primer cho sản phẩm có số băng ít nhất trong 3 primer đƣợc sử dụng. Tuy nhiên, các băng sản phẩm hầu nhƣ đều đa hình, chỉ có 1 băng đồng hình khoảng 300bp. Có 3 dòng nấm L61, L66 và L72 chỉ cho có 2 băng : 1 băng đồng hình và 1 băng đa hình. Điều này có thể là do đặc điểm di truyền của các dòng nấm làm hạn chế sự bắt cặp. Tuy vậy, 3 băng đa hình của 3 dòng nấm này có kích thƣớc khác nhau nên vẫn phân biệt đƣợc 3 dòng nấm này với nhau và với các dòng nấm khác trong đƣợc nghiên cứu trong khoá luận này. Băng sản phẩm lớn nhất 800bp chỉ xụất hiện duy nhất ở dòng nấm L64. Do đó có thể tiếp tục nghiên cứu primer này nhƣ chỉ thị phân tử cho các dòng nấm L61, L64, L66 và L72.
Primer OPL-05 cho ra nhiều băng sản phẩm hơn trên các dòng nấm (hình 4.7). Cao nhất là 10 băng. Với primer này cũng không có dòng nấm nào cho sản
phẩm RAPD giống nhau và tất cả các băng đều đa hình. Các băng do primer này tạo ra có kích thƣớc khá lớn ( khoảng 250 bp đến 2 kb).
Primer OPL-08 cho 11 băng sản phẩm, kích thƣớc khoảng 150 bp đến 1500bp (hình 4.8). Tất cả các băng đều là đa hình. Dòng nấm L61 chỉ cho 2 băng 350 bp và 550 bp, do đó có thể dễ dàng phân biệt dòng nấm này với 16 dòng nấm còn lại. Các dòng nấm L55, L56 và L58 có sản phẩm RAPD hoàn toàn giống nhau. Điều đó này cho thấy primer OPL-08 không thích hợp làm chỉ thị để phân biệt 3 dòng nấm này.
4.4. Đánh giá sự đa dạng di truyền của các dòng phân lập nấm R. solani
Kết quả điện di sản phẩm RAPD đƣợc mã hoá dạng nhị phân, có băng ghi 1, không có băng ghi 0 (Phụ lục ). Số liệu thu đƣợc đem xử lí bằng phần mềm NTSYS 2.1. Kết quả đƣợc hiển thị theo bảng ma trận tỷ lệ tƣơng đồng (bảng 4.2) và sơ đồ phân nhóm (hình 4.9)
Hình 4.9. Sơ đồ phân nhóm của 17 dòng phân lập nấm R.solani dựa trên kết quả RAPD với 3 primer OPM-13, OPL-05 và OPL-08
Qua hình 4.9 cho thấy tỷ lệ tƣơng đồng di truyền của 17 dòng nấm sử dụng trong nghiên cứu này biến thiên từ 53 - 89 %. Sơ đồ phân nhóm (hình 4.9) có nhiều nhánh, từ đó cho thấy có sự đa dạng di truyền giữa các dòng nấm nghiên cứu.
17 dòng phân lập nấm R. solani đƣợc chia làm 2 nhóm lớn nhƣ sau :
Nhóm 1 (N1) gồm 2 dòng nấm : L31, L38 có tỷ lệ tƣơng đồng khoảng 58%. Hai dòng nấm này có cùng hệ số di truyền, từ đó có thể thấy sự di truyền của 2 dòng nấm này có thể tƣơng đƣơng nhau.
Nhóm 2 (N2) là 1 nhóm lớn gồm 15 dòng nấm có tỷ lệ tƣơng đồng khoảng 56 - 89% . Trong nhóm này thì dòng nấm L66 (N2.1) có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền thấp nhất : 56% với các dòng nấm còn lại. Điều này cho thấy dòng nấm L66 rất khác biệt so với 14 dòng nấm còn lại. 14 dòng nấm còn lại (N2.2), có thể chia thành 2 nhóm nhỏ hơn :
- N2.1.1 gồm 12 dòng nấm L50, L54, L55, L56, L58, L59, L61, L651, L72, L75, L781 và L79 có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền từ 63 - 89%. Nhánh này chia làm nhiều nhánh nhỏ khác nhau. Điều này cho thấy là các dòng nấm này có cùng nguồn gốc nhƣng đã phân chia theo nhiều hƣớng khác nhau để thích nghi với môi trƣờng sống. Dựa vào sơ đồ phân nhóm ta có thể thấy di truyền của các dòng nấm khá xa nhau, nhƣ vậy có khả năng là sự mẫn cảm với thuốc bảo vệ thực vật của chúng có thể khác nhau.
- N2.1.2 gồm 2 dòng nấm L63 và L64 với tỷ lệ tƣơng đồng là 68%. Hai dòng nấm này cùng chung 1 nhánh nên tuy hệ số tƣơng đồng của 2 dòng nấm này
khá thấp (68%) nhƣng xét về tƣơng quan di truyền thì 2 dòng nấm này có quan hệ gần nhau hơn so với tƣơng quan di truyền với 15 dòng nấm còn lại.
Sơ đồ phân nhóm (hình 4.9) còn cho thấy sự khác biệt của các dòng nấm phân lập từ các vùng địa lí khác nhau. Hai dòng nấm L31 (Hải Phòng) và L38 (Nghệ An) (N1) thu thập từ miền Bắc và Bắc Trung bộ có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền khá thấp với 15 dòng phân lập còn lại đƣợc thu thập tại miền Trung, miền Nam và Tây Nguyên. Điều này có thể là do khí hậu của miền Bắc và Bắc Trung bộ có 4 mùa rõ rệt và thƣờng có mùa đông rất lạnh nên các dòng nấm đã tự biến đổi nhằm phù hợp với vùng địa lí sinh sống.
Trong 15 dòng phân lập nấm R. solani còn lại đƣợc thu thập từ miền Trung (L54, L55, L56, L58), Tây Nguyên (L50, L59, L63) và miền Nam (8 dòng còn lại) thì các dòng nấm phân lập từ Tây Nguyên có quan hệ khá gần với các dòng đƣợc phân lập từ miền Trung (tỷ lệ tƣơng đồng di truyền từ 65-84%), ngoại trừ dòng L63 (Lâm Đồng) có tƣơng quan di truyền rất gần với dòng L64 (Vũng Tàu) thu thập tại miền Đông Nam bộ (hình 4.9). Điều này cho thấy các dòng phân lập nấm R. solani
đƣợc thu thập tại các vùng địa lí lân cận nhau thì sẽ có tƣơng quan di truyền gần nhau. 12 dòng phân lậpở miền Trung, Tây Nguyên và miền Nam (N2.1.1) có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền khoảng 64% và chia làm 2 nhóm nhỏ trên sơ đồ phân nhóm. Hai nhóm này có chung một gốc. Điều này chứng tỏ các dòng phân lập nấm R. solani ở miền Trung, Tây Nguyên và miền Nam có chung một nguồn gốc nhƣng đã tiến hoá theo hai hƣớng khác nhau để phù hợp với môi trƣờng mới.
Các dòng phân lập nấm R. solani ở miền Nam cũng phân thành 2 nhóm rõ rệt với tỷ lệ tƣơng đồng là 67% cho hai miền Đông Nam bộ và Tây Nam bộ. Các dòng nấm phân lập tại các tỉnh Tây Nam bộ (L72, L75, L781, L79) có sự di truyền gần nhau hơn với tỷ lệ tƣơng đồng di truyền lên đến 76% (hình 4.9). Trong khi đó, các dòng nấm phân lập từ các tỉnh vùng Đông Nam bộ (L61, L64, L651, L66) có tỷ lệ tƣơng đồng khá thấp, chỉ khoảng 66%. Hơn nữa, hai dòng nấm L64 và L66 có hệ số tƣơng đồng khá thấp (56 và 66%) và tách biệt khỏi nhóm của các dòng phân lập nấm thu thập từ miền Trung và miền Nam trên sơ đồ phân nhóm (hình 4.9). Điều
này cho thấy đã có sự phát sinh những dòng nấm mới để phù hợp với sự thay đổi của môi trƣờng.
Ngoài ra, giữa các dòng phân lập nấm R. solani còn cho thấy sự khác biệt giữa các dòng nấm thu thập từ các vùng đất cao và thấp. Tỷ lệ tƣơng đồng di truyền giữa 2 dòng nấm L50 (thu thập ở Daklak) và L781 (thu thập ở Sóc Trăng) chỉ có 49%. Hay tỷ lệ tƣơng đồng của dòng phân lập R. solani thu thập tại Lâm Đồng (L63) và dòng nấm thu thập tại Sóc Trăng (L781) cũng chỉ có 49%. Điều này có thể là do sự khác biệt về khí hậu, nhiệt độ, ẩm độ và cả cách canh tác của các vùng này.
Ma trận tỷ lệ tƣơng đồng di truyền (bảng 4.2) cũng cho thấy rằng : các dòng phân lập nấm R.solani ở các tỉnh gần nhau thì thƣờng gần giống nhau. Ví dụ các dòng phân lập R. solani thu thập từ Bạc Liêu và Sóc Trăng có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền khá cao: 89% và tƣơng quan di truyền rất gần nhau (hình 4.9). Hay giữa 2 dòng phân lập R. solani thu thập từ Bình Định và Quãng Ngãi có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền khoảng 84%. Điều này cho thấy các dòng phân lập nấm R. solani ở các vùng lân cận nhau sẽ có di truyền tƣơng tự nhau. Nhƣ vậy, có khả năng sự đáp ứng với các biện pháp phòng trừ của các dòng nấm ở các vùng lân cận nhau sẽ tƣơng tự nhau. Điều này sẽ giúp cho việc đƣa ra các biện pháp phòng trừ nấm bệnh một cách tốt hơn.
Trong 17 dòng nấm phân lập dùng trong nghiên cứu này thì có dòng nấm L66 thu thập tại Tân Châu, Tây Ninh là có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền thấp nhất, chỉ khoảng 56%. Điều này cho thấy có thể tại Tân Châu đã xuất hiện dòng nấm mới để thích nghi với các biện pháp phòng trừ nấm bệnh tại đây. Do đó, cần phải nghiên cứu thêm về dòng nấm này để có thể đƣa ra biện pháp phòng trừ hữu hiệu hơn.
Nhƣ vậy, phân tích dữ liệu RAPD đã cho chúng ta thấy sự đa dạng di truyền của 17 dòng phân lập nấm R. solani trong khoá luận này. Ma trận tỷ lệ tƣơng đồng và sơ đồ phân nhóm còn cho thấy mối quan hệ di truyền giữa các dòng nấm. Các dòng nấm đƣợc thu thập tại các vùng càng gần nhau thì càng có tƣơng quan di truyền càng gần nhau và ngƣợc lại, các dòng thu thập tại các tỉnh càng xa nhau thì
tƣơng quan di truyền càng xa nhau. Ngoài ra, các dòng nấm thu thập từ các vùng có điều kiện khí hậu càng khác nhau thì có sự tƣơng quan di truyền càng xa nhau.
Với phổ kí chủ rộng, nấm R. solani rất dễ dàng lây truyền bệnh cho các vùng đất nông nghiệp lân cận với vùng lúa đã bị bệnh. Các nhà khoa học đã chứng minh đƣợc có đến 188 loại cây thuộc 32 họ là kí chủ của dòng nấm R. solani gây bệnh trên lúa. Khi điều kiện không thuận lợi cho sự sống và sinh sản, R. solani có thể tồn lƣu trong đất nhiều năm chờ điều kiện thuận lợi hoặc biến đổi để phù hợp