THỦY PHÂN TINH BỘT CỦA CHẾ PHẨM α-AMYLASE
Thực hiện thí nghiệm theo phần 3 mục 3.3.6. Sau khi đo hoạt tính bằng phƣơng pháp Heinkel, chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
4.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của α-amylase
Nhiệt độ (oC) ∆OD Tinh bột bị thủy phân (mg) Hoạt độ (UI/g CPE) 30 0,285 ± 0,0041 5,032 ± 0,075 838742 ± 12462 40 0,320 ± 0,0018 5,662 ± 0,032 943708 ± 5366 45 0,326 ± 0,0015 5,781 ± 0,027 963484 ± 4421 50 0,423 ± 0,0010 7,536 ± 0,018 1256069 ± 3042 55 0,446 ± 0,0009 7,962 ± 0,016 1327060 ± 2683 60 0,414 ± 0,0018 7,375 ± 0,032 1229194 ± 5366 65 0,309 ± 0,0038 5,464 ± 0,069 910748 ± 11519
Theo số liệu bảng 4.5 cho thấy nhiệt độ tối ƣu của α-amylase là 55oC với hoạt độ cao nhất là 1327061 (UI/g chế phẩm enzyme). Ở 60oC, hoạt độ α-amylase bắt đầu giảm xuống.
4.4.2. Ảnh hƣởng của pH
Cố định ở nhiệt độ tối thích là 55oC, thực hiện phản ứng thủy phân với giá trị pH thay đổi theo phần 3 mục 3.3.6.2. Kết quả đƣợc ghi nhận ở bảng 4.6 và đồ thị 4.6.
pH 5,8 6,0 6,2 6,4 6,6
Hình 4.3. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase
Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase
pH ∆OD Tinh bột bị thủy
phân (mg/ml) Hoạt độ (UI/g CPE) 5,8 0,433 ± 0,0033 7,734 ± 0,060 1255562 ± 9988 6,0 0,438 ± 0,0035 7,810 ± 0,064 1301707 ± 10685 6,2 0,419 ± 0,0013 7,469 ± 0,024 1244914 ± 4057 6,4 0,421 ± 0,0009 7,515 ± 0,016 1238829 ± 2683 6,6 0,402 ± 0,0003 7,156 ± 0,006 1192684 ± 1014
Từ bảng 4.6, chúng tôi thấy ở 55oC, pH tối ƣu của α-amylase là 6,0 với hoạt độ là 1301707 (UI/g chế phẩm enzyme).
1192684 1238829 1244914 1301707 1255562 1000000 1100000 1200000 1300000 1400000 5,8 6 6,2 6,4 6,6 pH Ho ạt đ ộ ( U I/ g C P E ) 0,31 1,29 1,18 1,17 0,0 0,5 1,0 1,5 1 2 3 4 Vcồn/Vdextrin D e x tr in ( g )
Đồ thị 4.6. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase 4.5. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TỶ LỆ CỒN 96% TỦA DEXTRIN
Bảng 4.7. Lƣợng dextrin thu đƣợc ở các tỷ lệ cồn 96%
Cồn 96% : dịch dextrin Khối lƣợng dextrin (g)
1:1 0,31 ± 0,021
2:1 1,29 ± 0,009
3:1 1,18 ± 0,019
4:1 1,17 ± 0,015
1,31 1,56 0,99 1,39 1,94 1,87 1,40 1,35 1,03 1,58 1,45 1,23 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 200 400 600
Độ pha loãng enzyme (lần)
D e x tr in ( g ) Bột gạo Bột nếp Bột bắp Bột năng Tỷ lệ cồn 96% để thu dextrin là 2:1, tỷ lệ cồn tăng thì khối lƣợng dextrin thu đƣợc giảm do lƣợng cồn càng nhiều làm cho lƣợng nƣớc trong dextrin tách ra càng nhiều.
4.6. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CỦA α-AMYLASE VỚI CÁC NGUỒN TINH BỘT
Thực hiện thí nghiệm theo phần 3 mục 3.3.8 với bột bắp, bột nếp, bột gạo, bột năng ở nồng độ 10%, 0,5 ml enzyme, thời gian thủy phân là 15 phút. Kết quả đƣợc ghi nhận ở bảng 4.8.
Bảng 4.8. Lƣợng dextrin (g) tạo thành do α-amylase thủy phân tinh bột 10%
Độ pha loãng CPE Khối lƣợng dextrin (g) Bột gạo Bột nếp Bột bắp Bột năng 200 1,03 ± 0,058 1,31 ± 0,032 0,99 ± 0,023 1,39 ± 0,018 400 1,40 ± 0,084 1,58 ± 0,061 1,23 ± 0,026 1,94 ± 0,044 600 1,35 ± 0,087 1,56 ± 0,04 1,45 ± 0,031 1,87 ± 0,053
Bảng 4.9. Hiệu suất thu dextrin
Độ pha loãng CPE (lần)
Hiệu suất thu dextrin (%)
Bột gạo Bột nếp Bột bắp Bột năng
200 51,67 ± 2,89 65,50 ± 1,61 49,33 ± 1,17 69,67 ± 0,08 400 69,83 ± 4,21 79,00± 3,04 61,33 ± 1,30 96,83 ± 2,19 600 67,67 ± 4,34 78,00 ± 2,02 72,50 ± 1,53 93,50 ± 2,65
Từ bảng 4.8 và bảng 4.9 cho thấy lƣợng dextrin thu đƣợc cao nhất khi sử dụng cơ chất là bột năng ở độ pha loãng CPE là 400 lần với lƣợng dextrin thu đƣợc là 1,94 gam, hiệu suất 96,83%.
4.7. KẾT QUẢ KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ BỘT NĂNG VÀ THỜI GIAN THỦY PHÂN HỒ BỘT NĂNG BẰNG CHẾ PHẨM α-AMYLASE PHÂN HỒ BỘT NĂNG BẰNG CHẾ PHẨM α-AMYLASE
Theo bảng 4.8 và 4.9, chúng tôi thấy α-amylase thủy phân tốt ở độ pha loãng 400 lần. Vì vậy chúng tôi tiến hành thí nghiệm này với chế phẩm α-amylase pha loãng 400 lần.
Sau khi tiến hành thí nghiệm khảo sát sơ bộ sự thủy phân tinh bột với các thể tích α-amylase pha loãng 400 lần, chúng tôi chọn ra những thể tích thích hợp để thực hiện thí nghiệm này: thể tích α-amylase cho vào 20 g hồ tinh bột năng 10% và 15% là 0,5 ml enzyme; 20 g hồ tinh bột năng 20% là 1,5 ml enzyme. Kết quả ghi nhận ở bảng 4.10, 4.11 và 4.12.
Bảng 4.10. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 10%
Thời gian thủy phân (phút) Khối lƣợng dextrin (g) Hiệu suất (%)
10 1,93 ± 0,032 96,5 ± 1,61
20 1,86 ± 0,015 93,17 ± 2,73
30 1,72 ± 0,055 85,83 ± 0,77
1,93 1,86 1,72 1,62 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 10 20 30 40
Thời gian thủy phân (phút)
D e x tr in ( g ) 2,01 2,37 2,03 1,93 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 10 20 30 40
Thời gian thủy phân (phút)
D e x tr in ( g )
Biểu đồ 4.3. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ bột năng 10%
Sau khi thủy phân hết tinh bột, α-amylase sẽ chuyển sang thủy phân
dextrin. Vì vậy, nếu kéo dài thời gian thủy phân lƣợng dextrin thu đƣợc sẽ thấp dần.
Bảng 4.11. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 15%
Thời gian thủy phân (phút) Khối lƣợng dextrin (g) Hiệu suất (%)
10 2,01 ± 0,071 67 ± 2,36
20 2,37 ± 0,065 78,89 ± 2,16
30 2 ± 0,081 66,67 ± 2,69
40 1,93 ± 0,069 64,22 ± 2,31
2,25 2,51 2,36 2,30 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 10 20 30 40
Thời gian thủy phân (phút)
D e x tr in ( g )
Bảng 4.12. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 20%
Thời gian thủy phân (phút) Khối lƣợng dextrin (g) Hiệu suất (%)
10 2,25 ± 0,072 56,25 ± 1,81
20 2,507 ± 0,086 62,67 ± 2,14
30 2,363 ± 0,102 59,08 ± 2,54
40 2,303 ± 0,064 57,58 ± 1,59
Biểu đồ 4.5. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ bột năng 20%
Đối với hồ bột năng 15% và 20%, do nồng độ tinh bột cao làm cho khả năng thủy phân tinh bột của α-amylase giảm nên hiệu suất thu dextrin không cao. Ở 30 và 40 phút mặc dù lƣợng tinh bột vẫn còn nhiều nhƣng lƣợng dextrin thu đƣợc vẫn không tăng.
Khối lƣợng dextrin thu đƣợc nhiều nhất khi thủy phân bột năng 10% là 1,93 g đạt hiệu suất là 96,5% và thời gian thủy phân là 10 phút (theo bảng 4.10).
Đối với dung dịch bột năng 15%, lƣợng dextrin nhiều nhất là 2,37 g, hiệu suất 78,89% và thời gian thủy phân là 20 phút (theo bảng 4.11).
Dung dịch bột năng 20% có lƣợng dextrin cao nhất là 2,5 g, hiệu suất 62,67% và thời gian thủy phân là 20 phút (theo bảng 4.12).
Chƣơng 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
- Thời gian nuôi cấy tốt nhất để thu α-amylase từ Bacillus subtilis là 48 giờ. - Tinh sạch sơ bộ dịch chiết α-amylase từ canh trƣờng nuôi cấy bằng cồn 96% tốt hơn (NH4)2SO4 với tỷ lệ cồn 96% thích hợp nhất là 1:3 với hiệu suất thu enzyme theo hoạt độ là 90,84% và gian tủa là 15 phút.
- Nhiệt độ và pH tối ƣu cho hoạt động thủy phân của α-amylase tƣơng ứng là 55oC và 6,0.
- Lƣợng dextrin thu đƣợc cao nhất (1,94 g) đạt hiệu suất 96,83% khi thủy phân bột năng (khoai mì) 10%.
5.2. ĐỀ NGHỊ
- Tối ƣu các điều kiện nuôi trên khay để thu α-amylase có hoạt độ cao hơn. - Tủa enzyme ở nhiều nồng độ cồn khác nhau.
- Xác định lƣợng tinh bột có trong các nguồn tinh bột khảo sát. - Định lƣợng dextrin thật trong chế phẩm dextrin.
- Tách và khảo sát tính chất các phân đoạn dextrin từ sản phẩm dextrin thu đƣợc; nghiên cứu ứng dụng chế phẩm dextrin vào trong chế biến thực phẩm và y dƣợc.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Lâm Thị Kim Châu, Nguyễn Nhƣ Nhứt, 2006. Phương pháp kiểm tra một số enzyme dùng trong chăn nuôi. Giáo trình khoa Sinh Học Bộ môn Sinh Hóa Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP. Hồ Chí Minh, tr. 16 - 17. 2. Lâm Thị Kim Châu, Văn Đức Chín, Ngô Đại Nghiệp, 2004. Thực tập lớn
sinh hóa. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia, TP. Hồ Chí Minh, tr. 36 – 46. 3. Lê Hồng Phú, 2000. Khảo sát qui trình điều chế dextrin từ một số loại
tinh bột bằng sự thủy giải bởi acid HCl. Khóa luận tốt nghiệp Khoa Sinh Học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP. Hồ Chí Minh.
4. Lƣơng Đức Phẩm, 1998. Công nghệ vi sinh vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội, tr. 249 – 257.
5. Nguyễn Đức Duy Anh, 2005. Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus và thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học. Khóa luận tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm, TP.Hồ Chí Minh.
6. Nguyễn Đức Lƣợng, 2004. Công nghệ sản xuất mì chính và các sản phẩm lên men cổ truyền. Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật.
7. Nguyễn Quỳnh Nam, 2006. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo và thử đối kháng với Echerichia coli gây bệnh tiêu chảy tr ên heo. Luận văn tốt nghiệp Khoa Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh.
8. Nguyễn Tiến Thắng, 2002. Giáo trình Công nghệ enzyme. Viện Sinh Học Nhiệt Đới, TP. Hồ Chí Minh, tr. 42- 73.
9. Nguyễn Thị Nhƣ Thủy, 2005. Khảo sát các đặc tính của enzyme amylase thu nhận từ hai chủng nấm mốc Aspergillus niger và Aspergillus oryzae. Khóa luận cử nhân khoa học ngành Sinh Hóa, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh.
10. Nguyễn Thị Thu Thủy, 2006. Khảo sát khả năng tổng hợp α-amylase và một số điều kiện kỹ thuật ảnh hưởng lên quá trình tăng sinh của Bacillus
sp. Báo cáo thực tập tốt nghiệp ngành Sinh Hóa, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh.
11. Nguyễn Xuân Thủy, 2001. Khảo sát qui trình điều chế dextrin từ một số loại tinh bột bằng sự thủy giải bởi enzyme. Khóa luận cử nhân khoa học ngành Sinh Học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP. Hồ Chí Minh.
12. Phạm Thị Ánh Hồng, 2003. Kỹ Thuật Sinh Hóa. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh.
13. Trần Đỗ Quyên, 2004. Thu nhận và khảo sát hoạt tính của chế phẩm alpha amylase từ Bacillus subtilis. Báo cáo thực tập tốt nghiệp ngành Sinh Hóa, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. HCM.
14. Trần Linh Thƣớc, 2005. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong thực phẩm và mỹ phẩm. NXB Giáo Dục, tr. 65 – 71.
Tài liệu tiếng Anh
15. K. Clarkson, B. Jones, R. Bott, B. Bower, G. Chotani, T. Becker, Enzymes: Screening, Expression, Design and Production, Enzymes in Farm Animal Nutrition (Michael R. Bedford, Gary G. Partridge). CABI publishing, OCAB International, 2001, p. 337 – 346.
Tài liệu từ internet
16. Ngô Xuân Mạnh, Võ Nhân Hậu, Nguyễn Thị Tú. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho việc thu nhận α-amylase chịu nhiệt từ vi khuẩn Bacillus licheniformis.
< http://www.hau1.edu.vn/tc_khktnn/upload%5CVoNhanHau_kt&cn52005.pdf> 17. Steven J. McWethy, Paul A. Hartman. Purification and Some
Propeerties of an Extracellular Alpha-amylase from Bactriodes amylophilus. Journal of Bacteriology, March. 1977, p. 1537 – 1544. (URL: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=235133)
18. Janusz Kapusniak, Anna Tyflewska. The utilisation of dextrins from the thermolysis of starch with biogenic amino acids by Lactobacillus rhamnosus bacteria. Food, Agriculture & Enviroment Vol 2 (1): 153 – 159. 2004, Science and Technology, WFL Publisher.
19. Hopek M., Ziobro R, Achremowicz B., 2006. Comparison of the effects of microbial a-amylase and scalded flour on bread quality. Acta Sci. Pol, Technol. Aliment .5(1), 97 – 106.
<URL: http://www.food.actapol.net/pud/8_1_2006.pdf>
20. O. S. AZEEZ, 2005. Production of Dextrins from Cassava Starch. Chemical Engineering Department, Federal University of Technology, Minna, Nigeria, Lenardo Journal of Sciences ISSN 1583 – 0233.
<URL: http://ljs.academicdirect.org/A07/09_16.pdf>
21. Dextrin. The Colombia Encylopedia, Sixthedition. Copyright 2001 - 05 Colombia University Press.
<URL:http:// www.bartleby.com/65/de/dextrin.html> 22. Bacillus subtilis
<URL: http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillussubtilis> <URL: http://www.epa.gov/oppt/biotech/pubs/fra/fra009.htm>
PHỤ LỤC
1. THÀNH PHẦN MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƢỜNG 1.1. Môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu đƣờng pepton agar
Giá đậu 100g D-glucose 50g Pepton 10g Agar 20g Nƣớc cất đủ 1000 ml pH = 7
Đun sôi 100g giá với 1000 ml nƣớc cất trong 30 phút, để nguội. Lọc nƣớc giá bằng vải lọc và định mức lại cho đủ 1000 ml. Cho glucose, pepton, agar vào và đun sôi, khuấy đều. Phân vào từng ống nghiệm, mỗi ống khoảng 10 ml môi trƣờng, hấp khử trùng ở 1atm trong 30 phút. Các ống nghiệm sau khi hấp đƣợc để nghiêng.
1.2. Môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu đƣờng pepton
Giá đậu 100g
D-glucose 50g
Pepton 10g
Nƣớc cất đủ 1000 ml
pH = 7
Cho Glucose, pepton vào nƣớc chiết giá, khuấy đều và cho vào các erlen. Hấp khử trùng ở 1atm trong 30 phút.
1.3. Môi trƣờng nuôi cấy bán rắn Bã đậu nành 50g Cám bắp 50g NaCl 0.36g CaCl2 0.6g DAP 0.2g MgSO4 0.5g Nƣớc cất đủ 135 ml pH = 7 2. CÁC PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN 2.1. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc
Khác với phƣơng pháp đếm trực tiếp dƣới kính hiển vi, phƣơng pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lƣợng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu.
Ƣu điểm của phƣơng pháp này là độ nhạy cao, cho phép định lƣợng vi sinh vật ở mật độ thấp trong mẫu.
Cách thực hiện
- Pha loãng mẫu theo dãy thập phân:
Mẫu đƣợc pha loãng tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân: hút 1 ml mẫu (hoặc dung dịch có độ pha loãng trƣớc đó) vào ống nghiệm chứa 9 ml nƣớc cất đã khử trùng, lắc đều.
- Sau khi đã pha loãng thành các nồng độ 10-3,10-4, 10-5, 10-6,… hút 1 ml dịch pha loãng ở mỗi nồng độ cho vào đĩa petri. Đổ khoảng 15 – 20 ml môi trƣờng đã khử trùng và để nguội đến 45 - 50oC vào đĩa petri có mẫu.
- Xoay nhẹ đĩa petri cùng chiều và ngƣợc chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch giống đƣợc trộn đều trong môi trƣờng cấy.
- Đậy nắp đĩa petri, để đông tự nhiên, lật ngƣợc đĩa.
Tính kết quả
Mật độ tế bào vi khuẩn trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng Di đƣợc tính theo công thức:
Mi (CFU/ml) = Ai x Di/V Trong đó: Ai là số khuẩn lạc trung bình /đĩa Di là độ pha loãng
V là dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml).
Mật độ tế bào trung bình MI trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở các nồng độ pha loãng khác nhau.
2.2. Phƣơng pháp đo độ đục
Nguyên tắc
Khi một pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trƣờng lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới.
Tế bào vi sinh vật cũng là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trƣờng cũng làm môi trƣờng trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào.
Tiến hành
- Xây dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào:
Các huyền phù của vi sinh vật cần kiểm nghiệm đƣợc pha loãng và đo OD610nm đạt các giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5.
Dùng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc xác định mật độ tế bào (N/ml) của các huyền phù này.
Tính giá trị log(N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tƣơng ứng với mỗi độ đục. Vẽ đƣờng biểu diễn của log(N/ml) (trục tung) theo OD610nm (trục hoành). Xác định