Năm 1926, Painter là ngƣời đầu tiên báo cáo số lƣợng nhiễm sắc thể thỏ là 2n = 44, sau đó rất nhiều báo cáo về kiểu nhân của thỏ trên nhiều loại tế bào khác nhau (Kannan và ctv, 2006). Năm 1962, Sarkar và ctv đã nuôi cấy lớp tế bào giác mạc và mô của phổi, Nicolai và Shaver (1977) sử dụng phôi nang sáu ngày tuổi của thỏ để nghiên cứu NST. Năm 2002, Hayes đã nguyên cứu kiểu nhân thỏ trên nguyên sợi bào. Và trong thời gian gần đây đã có những báo cáo về kiểu nhân NST thỏ trên tế bào bạch cầu nhƣ Parkányi và ctv (2004), Kannan và ctv (2006).
Dựa theo vị trí của centromere chia NST thỏ thành bốn dạng metacentric, submetacentric, subtelocentric và telocentric. Mỗi nhóm đƣợc xếp theo kiểu hình và chiều dài giảm dần. Theo Ford và ctv (1980), nhiễm sắc thể của thỏ đƣợc nhuộm theo kỹ thuật G – bading và đã đƣợc Hội nghị Quốc tế giới giới thiệu jiểu nhân nhƣ sau:
Bảng 1.2 Đặc điểm các băng trên nhiễm sắc thể thỏ Nhiễm sắc
thể thứ Đặc điểm
1
p: ba băng tối khoảng cách bằng nhau. Băng trung tâm nổi bật
q: băng tối hẹp kề sát centromere. Hai băng tối gần tâm. Băng trung tâm rộng, sáng và hai băng tối xa tâm.
2
p: ba băng tối khoảng cách bằng nhau.
q: băng tối hẹp kề centromere. Hai băng tối gần tâm. Hai băng tối xa tâm.
3 p: băng tối gần tâm. Băng tối xa tâm q: ba băng tối khoảng cách bằng nhau.
4 p: băng trung tâm tối q: hai băng trung tâm tối
5 p: băng tối kề sát centromere q: băng tối gần tâm.
6 p: băng tối gần centromere q: băng trung tâm tối
7 p: băng trung tâm tối.
q: hai băng tối gần tâm. Băng trung tâm sáng và hai băng tối xa tâm.
8 p: băng tối xa tâm. Băng hẹp gần tâm thỉnh thoảng hiển nhiên q: ba băng tối có khoảng cách bằng nhau. Băng gần tâm phân hai.
9 p: băng gần tâm tối.
10 p: băng rộng, tối kề sát centromere. Băng trung tâm tối.
q: băng tối hẹp gần tâm. Băng tối xa tâm có thể phân thành hai.
11 p: băng trung tâm tối.
q: băng trung tâm tối. Băng xa tâm tối
12
p: băng gần tâm tối.
q: băng sáng kề sát centromere. Hai băng gần tâm tối. Băng trung tâm tối. Hai băng xa tâm tối.
13 p: băng trung tâm tối.
q: băng tối kề sát centromere. Hai băng trung tâm tối. Xa tâm sáng.
14
p: băng trung tâm tối.
q: hai băng gần tâm tối. Hai băng xa tâm tối.
15 p: băng trung tâm tối.
q: bốn hoặc năm băng tối khoảng cách bằng nhau.
16 p: băng xa tâm tối, hẹp.
q: băng gần tâm tối. Băng xa tâm tối.
17 p: băng trung tâm hẹp, tối.
q: ba băng tối khoảng cách bằng nhau
18 q: băng tối hẹp nằm gần centromere. Băng tối trung tâm có thể tách làm hai. Băng tối hẹp xa tâm
19 q: băng tối nằm gần centromere. Băng trung tâm tối. Băng tối hẹp xa tâm
20 q: băng tối nằm gần centromere. Băng tối trung tâm
21 q: băng tối nằm gần centromere. Xa tâm sáng
X p: băng nằm gần tâm sáng. Băng nằm xa tâm tối q: băng nằm gần tâm tối. Hai băng tối nằm xa tâm
Y p: băng tối kéo dài từ gần tâm đến xa tâm q: có thể không bắt màu nhuộm
Parkányi và ctv (2004) sau khi nhuộm bằng kỹ thuật G – banding và xây dựng kiểu nhân trên NST thỏ cũng đã đƣa ra năm dạng NST thỏ là: metacentric, submetacentric, subtelocentric, telocentric và acrocentric. Kiểu nhân đƣợc trình bày bởi Parkányi không có sự khác biệt với kiểu nhân đƣợc Hội đồng Quốc tế đƣa ra. Vì từ năm 1975, John và Freeman sau rất nhiều nghiên cứu trên kiểu hình nhiễm sắc thể đã cho rằng kiểu hình acrocentric cũng có thể bao gồm telocentric (Eldridge, 1985). Vì kiểu hình của arcocentric và telocentric đều không nhìn thấy đƣợc nhiễm sắc chất ở vế ngắn trong giai đoạn trung kỳ của tế bào, còn kiểu hình subtelocentric có thể thấy đƣợc trong giai đoạn trung kỳ.
(Ford và ctv, 1980) (Parkányi và ctv, 2004)
Chƣơng 3
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Thời gian và địa điểm
־ Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 4 đến tháng 8 năm 2007.
־ Thỏ đƣợc nuôi tại trại bò Sarec, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. ־ Máu thỏ đƣợc nuôi cấy Phòng Nuôi Cấy Tế Bào và phân tích tại Phòng Sinh Lý Động Vật, Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
3.2 Đối tƣợng
Đề tài thực hiện chủ yếu trên máu của thỏ có trọng lƣợng từ 2 – 3 kg.
3.3 Nội dung nghiên cứu
־ Máu thỏ đƣợc lấy và nuôi cấy để thu nhận đƣợc các tế bào lympho ở trung kỳ, sau đó tiến hành nhuộm với giemsa.
־ Xem mẫu dƣới kính hiển vi để xác định hình dạng NST thỏ.
3.4 Vật liệu và hóa chất 3.4.1 Thiết bị 3.4.1 Thiết bị ־ Tủ ấm ־ Tủ ấm CO2 ־ Tủ cấy vô trùng ־ Máy ly tâm ־ Kính hiển vi độ có máy chụp ảnh ־ Máy ảnh kỹ thuật số ־ Tủ lạnh -200C ־ Tủ lạnh 40C ־ Cân điện tử ־ Bồn ủ nhiệt ־ Máy vi tính
3.4.2 Dụng cụ
־ Micro pipette loại 100 - 1000 μl, 10 - 100 μl ־ Đầu típ tƣơng ứng với các loại micro pipette ־ Ống nghiệm 15ml, chai Rough, eppendorf ־ Ống kháng đông có tráng heparin
־ Chai nắp xanh 250ml và 1000ml
־ Kim tiêm, ống chích, găng tay, khẩu trang và phiến kính
3.4.3 Hóa chất
a) Các chất trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào bạch cầu:
1) Môi trƣờng RPMI 1640 (1X) của hãng Gibco BRL
- Thành phần: L glutamine và 25mM HEPES trong 500ml môi trƣờng.
- Chức năng: Là môi trƣờng chính nuôi cấy tế bào bạch cầu, cung cấp dinh dƣỡng, ổn định nồng độ CO2 5% và pH cho sự phát triển tế bào. 2) Pokeweed
- Thành phần: 10 mg lectin trong 10 ml PBS
- Chức năng: là tác nhân chính kích thích bạch cầu phân bào. 3) Huyết thanh thai bò (FBS) đã đƣợc bất hoạt bằng nhiệt
- Chức năng: cung cấp đạm, hấp thu các ion kim loại độc. Nếu thiếu, tế bào không phân bào mà chuyển sang giai đoạn G0.
4) Antibiotic – Antimycotic (100X)
- Thành phần: 10000 IU/ml penicilin G sodium, 10000 µg/ml streptomicin sulfate, 25 µg/ml amphotericin trong dung dịch muối 0.85%.
- Chức năng: ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây hại cho tế bào. 5) Colcemid (10 µg/ml)
- Chức năng: phá hủy thoi vô sắc của tế bào ức chế sự nhân đôi của centromere của NST làm tế bào dừng lại ở giai đoạn trung kỳ.
Bảng 3.1 Môi trƣờng nuôi cấy 0,4 và 1 ml máu
Tên hóa chất Dung tích
RPMI 1640 (1X) 8 ml
FBS 1 ml
Pokeweed 80 µl
Antibiotic – Antimycotic (100X) 100 µl
Colcemid 40 µl
b) Các dung dịch trong quá trình nhuộm nhiễm sắc thể
1) Dung dịch nhƣợc trƣơng KCl 0,075 M
- Thành phần: 0,56 g KCl trong 100 ml nƣớc khử ion. - Tác dụng làm tăng thể tích tế bào lên.
2) Dung định cố định
- Thành phần: 3 methanol : 1 acid axetic
- Chức năng: giữ tế bào tình trạng trƣơng phòng, loại bỏ lipid, biến tính protein nên làm màng tế bào và màng nhân rất mỏng dể giải phóng NST.
3) Dung dịch nhuộm
- Thành phần: 8 ml giemsa trong 100 ml dung dịch sorensen buffer. - Chức năng: nhuộm nhiễm sắc thể.
c) Một số dung dịch khác
1) Nồng độ các chất trong giemsa Tên hóa chất Liều lƣợng Giemsa 1 g
Methanol 50 ml
2) Nồng độ các chất trong dung dịch PBS (phosphate buffer saline) Tên mg/50 ml mg/100 ml NaCl 400 800 KCl 10 20 Na2HPO4.12H2O 145 290 H2PO4 10 20
3) Nồng độ các chất trong dung dịch đệm (Sorensen buffer) Tên hóa chất g/500 ml nƣớc cất g/1000 ml nƣớc cất KH2PO4 4,54 9,078
Na2HPO4 5,94 11,876
3.5 Bố trí thí nghiệm
3.5.1 Thí nghiệm 1: khảo sát thời gian ủ mẫu với colcemid
- Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát tác động của colcemid theo thời gian đối với tế bào nuôi cấy để thu nhận đƣợc tế bào trung kỳ nhiều nhất.
- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc chia làm 3 nghiệm thức theo thời gian ủ với colcemid là 20 phút, 40 phút, 60 phút trƣớc khi nhuộm. Tƣơng ứng với mỗi nghiệm thức là một lô thí nghiệm gồm có 10 mẫu, bố trí theo kiểu một hoàn toàn ngẫu nhiên. Mỗi mẫu chúng tôi tiến hành nhuộm trên sáu phiến kính.
3.5.2 Thí nghiệm 2: khảo sát lƣợng máu nuôi cấy
- Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát lƣợng máu nuôi cấy thích hợp để thu nhận đƣợc tế bào ở giai đoạn trung kỳ nhiều nhất.
- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc chia làm hai nghiệm thức là nuôi cấy máu với thể tích 0,4 ml và 1ml. Tƣơng ứng với mỗi nghiệm thức là một lô thí nghiệm gồm 15 mẫu, bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên.
3.5.3 Thí nghiệm 3: tiến hành nuôi cấy trên ống nghiệm 15 ml.
- Mục đích thí nghiệm: khảo sát khả năng dùng ống nghiệm 15 ml nuôi cấy tế bào bạch cầu để thay thể cho chai Rough
- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm chia làm 2 nghiệm thức là nuôi cấy trên chai Rough và ống nghiệm 15 ml với lƣợng máu là 1 ml và theo thời gian ủ với colcemid là 60 phút. Tƣơng ứng với mỗi nghiệm thức là một lô thí nghiệm có 3 mẫu. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Mỗi mẫu chúng tôi tiến hành nhuộm trên sáu phiến kính.
3.5.4 Chỉ tiêu quan sát
Số mẫu nhuộm thành công: là số mẫu có phiến kính nhuộm thành công. Số phiến kính nhuộm thành công: là những phiến kính có bạch cầu ở giai đoạn trung kỳ.
Số lƣợng tế bào bạch cầu ở trung kỳ thu đƣợc theo từng thí nghiệm.
3.6 Phƣơng pháp tiến hành
3.6.1 Phƣơng pháp lấy máu thỏ: 3.6.1.1 Phƣơng pháp lấy máu tim 3.6.1.1 Phƣơng pháp lấy máu tim
Đầu tiên thỏ đƣợc cố định và xác định vị trí tim. Tim nằm ở giữa sụn mấu kiếm và xƣơng sƣờn đầu tiên, hơi lệch về phía trái đƣờng trắng khoảng 1cm. Sau khi cạo sạch lông và sát trùng nơi cần lấy máu với cồn, dùng xylanh 5ml đâm thẳng một cách nhẹ nhàng và từ từ hút 4ml máu. Sau khi hút, máu đƣợc chuyển nhanh qua ống kháng đông chứa heparin, chú ý lắc nhẹ và đều ống. Trƣớc khi lấy máu, không đƣợc cho thỏ ăn no, vì khi no thỏ rất dễ bị sốc và gây tử vong.
3.6.1.2 Phƣơng pháp lấy máu động mạch tai
Đầu tiên thỏ đƣợc cố định, xác định động mạch ở giữa tai, cạo sạch lông và sát trùng với cồn nơi cần lấy. Đâm kinh nhẹ vào động mạch sau đó dùng ngón cái và ngón giữa để giữ kim cố định, đồng thời rút từ từ khoảng 4ml máu, rồi chuyển nhanh qua ống kháng đông chứa heparin. Chú ý lắc nhẹ và đều ống để máu trộn đều với heparin.
Hình 3.1 Phƣơng pháp lấy máu động mạch tai
3.6.2 Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào máu
Máu sau khi đƣợc lấy chuyển nhanh tới phòng thí nghiệm để nuôi cấy. Dùng micro pipette hút môi trƣờng nuôi cấy theo bảng 3.1 vào chai Rough hay ống nghiệm 15 ml tùy theo bố trí thí nghiệm. Sau đó dựng đứng bình, trộn thật nhẹ để môi trƣờng đều.
Trƣớc khi hút máu vào môi trƣờng, phải dựng đứng ống kháng đông từ một đến hai giờ. Vì sau thời gian này, máu sẽ phân tách thành hai lớp. Lớp dƣới là hồng cầu và lớp trên rất nhiều bạch cầu. Sau đó hút lƣợng máu theo kiểu bố trí thí nghiệm vào môi trƣờng nuôi cấy. Chú ý phải lắc nhẹ và đều để máu hòa đều vào môi trƣờng. Thao tác này rất quan trọng vì nó quyết định đến sản phẩm nuôi cấy. Bình nuôi cấy đƣợc chuyển vào tủ ấm CO2 và nuôi cấy ở 370C trong 72 giờ. Đối với chai Rough thì đậy chặt nắp còn đối với ống nghiệm 15 ml thì không đƣợc đậy nắp chặt. Ống 15ml phải đƣợc đặt cố định, nghiêng 300 so với mặt phẳng.
Trong thời gian nuôi cấy phải lắc nhẹ chai Rough và ống nghiệm 15 ml từ một đến hai trong một ngày. Điều này sẽ làm cho hồng cầu lắng xuống đáy và tế bào bạch cầu phân chia nhiều hơn (Kannan và ctv, 2006).
Chai Rough Ống nghiệm 15 ml
Hình 3.2 Nuôi cấy tế bào bạch cầu 3.6.3 Kỹ thuật nhuộm nhiễm sắc thể
3.6.3.1 Kỹ thuật trải đều nhiễm sắc thể
Quy trình nhuộm đƣợc tham khảo theo quy trình của Seabright (1971) Bƣớc 1: Sau khi ủ 72 giờ, cho colcemid vào môi trƣờng nuôi cấy tế bào và đặt vào tủ ấm 20 phút, 40 phút, 60 phút trƣớc khi đem cố định để nhuộm.
Bƣớc 2: Sau khi ủ, chuyển môi trƣờng nuôi cấy vào ống nghiệm 15 ml và ly tâm ở tốc độ 1200 vòng/phút trong 10 phút. Sau đó loại bỏ hầu hết phần nổi, chỉ lấy khoảng 0,5 ml dịch tế bào còn lại.
Bƣớc 3: Trộn đều dịch tế bào trong phần môi trƣờng còn giữ lại và cẩn thận cho thêm 2 ml KCl 0,075 M đã làm ấm trƣớc ở 370C, cho từng giọt một, nếu cho quá nhanh tế bào rất dễ vỡ trƣớc khi đƣợc cố dịnh. Sau đó khi khuấy nhẹ và tiếp tục cho thêm dung dịch KCl cho đến khi thể tích đạt 12ml.
Bƣớc 4: Ủ ống nghiệm 15 phút ở 370C trong water bath.
Bƣớc 5: Cho 1ml dung dịch cố định vào (hỗn hợp 3 methanol : 1 acid axetic) vào và đậy ống ly tâm lại và trộn đều bằng cách đảo ống.
Bƣớc 6: Ly tâm, bỏ nổi nhƣ bƣớc 2.
Bƣớc 7: Tiếp tục thêm 3 ml dung dịch cố định vào và dùng micro pipette để trộn thật đều và mạnh một đến hai phút để các tế bào bạch cầu tách rời ra và dịch tế bào đồng nhất.
Chú ý: bƣớc này rất quan trọng cho chất lƣợng của mẫu. Sau đó thêm dung dịch cố định cho đạt thể tích 10 ml và trộn đều.
Bƣớc 8: Sau đó đem ủ 15 phút ở 40C, ly tâm bỏ nổi nhƣ bƣớc 2.
Bƣớc 9: Lặp lại quá trình cố định ở bƣớc 7 - 8 ba lần nữa. Chỉ trộn nhẹ và không cần ủ lạnh giữa các lần ly tâm. Cuối cùng ta thu đƣợc lƣợng bạch cầu trong 0,5 ml dung dịch cố định.
Bƣớc 10: Sau lần ly tâm cuối cùng, ta thu đƣợc lƣợng bạch cầu trong 0,5 ml dung dịch cố định. Dùng pipette Pasteur hút 50 µl dịch tế bào, đặt pipette vuông góc với phiến kính khoảng cách 60 cm, sau đó nhỏ từng giọt xuống phiến kính. Thao tác này sẽ giúp cho NST sẽ trải đều trên mặt phiến kính. Chú ý: phiến kính phải sạch và phải đặt ở -200C trong 30 phút trƣớc khi sử dụng.
3.6.3.2 Nhuộm nhiễm sắc thể với giemsa
Sau khi trải tế bào trên phiến kính, để phiến kính khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng.
Ngâm phiến kính vào dung dịch nhuộm 15 phút, rữa nhẹ bằng nƣớc sau đó để khô rồi xem dƣới kính hiện vi ở độ phóng đại 1000 lần.
Hình ảnh nhiễm sắc thể đƣợc chụp lại và xử lý trên phần mềm photoshop.
3.7 Xử lý số liệu
Mặc dù bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên một yếu tố, chúng tôi không xử lý thống kê mà nhận định do tỷ lệ thành công còn rất thấp.
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả nhuộm theo thời gian ủ với colcemid
Sau khi nuôi cấy 72 giờ để các tế bào lympho trong máu thỏ đạt giai đoạn trung kỳ, mỗi bình nuôi cấy đƣợc cho thêm 40 µl colcemid (10 µl/ml) và đem ủ ba mức thời gian là 20, 40, 60 phút để chọn ra thời gian ủ tối ƣu nhất. Kết quả nhuộm theo thời gian ủ với colcemid đƣợc trình bày ở bảng 4.1
Bảng 4.1: Số lƣợng tế bào đạt trung kỳ theo thời gian ủ colcemid
Thời gian 20 phút 40 phút 60 phút Số mẫu 10 10 10 Số mẫu thành công 0 2 4 Số phiến kính quan sát 60 60 60 Số phiến kính thành công 0 4 8 Tỷ lệ phiến kính thành công (%) 0 6,66 13,33 Số tế bào thành công 0 6 17
Từ kết quả trên, chúng tôi nhận thấy quá trình ủ mẫu máu nuôi cấy với 40