Phản ứng PCR với cặp primer đã lựa chọn
Thành phần Thể tích sử dụng Nồng độ đầu Nồng độ cuối
HN buffer 2,5 μl 10X 1X
MgCl2 0,75μl 50mM 1.5mM
dNTPs 0,2μl 25mM 0,2mM
Primer forward 0.5μl 10 μmol/ μl 0,2 μmol/ μl Primer reverse 0.5μl 10 μmol/ μl 0,2 μmol/ μl
DNA mẫu 0.5μl
H2O cất 19,85μl Tổng thể tích: 25µ
Bảng 3.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian
1 94 2 phút 2 - 29 94 30 giây 55-60 30 giây 72 1 phút 30 72 5 phút 31 4 Forever
Lƣu ý: Sau khi phản ứng PCR hoàn chỉnh, chờ cho nhiệt độ trong máy về 4oC trong 5 phút. Đem sản phẩm trữ ở 4o
C hay -20oCđể có thể sử dụng với trong thí nghiệm sau này. Các thao tác tiến hành pha mix phải thực hiện trong tủ cấy để đảm bảo điều kiện vô trùng và các thành phần phải luôn đƣợc giữ trong điều kiện lạnh .
Trình tự của các primer sử dụng trong đề tài theo chiều 5’ – 3’
Bảng 3.3: Trình tự các SSR’Primer sử dụng
Primer Trình tự (5’-3’) Nucleotide lặp lại
Am008 F: CCACCCGTTACCCATTTATG R: CCGTGATTGACTCTCAGCG (TG)14 Am012 F: TGAGTCGATCGCTTAGCTTG R: TCCCGTTATTATGCCAAAGTG (TC)15(AC)7-(AC)10AG Am014 F: TACTAACGTTGCTATATGAGAAAGG R: CTGGTTGTTCGCTTATATGG (ATAC)3(AC)26(AT)3,(GTAT)2(AT)3AC
Am018 F: CACGGCTGTTATTTCCTTCG R: GGAAAGAGGTGTGACAGAGGAC (AC)14 Am326 F: GGACCAAACTTATGCAACACC R: GCATCAATGTACTAAACCATTTCC (CA)20 Am341 F: CCATTCGAGCATCCTAAGAG R: CGTATGGCTGAGCTACTTAATCA (CA)12(TA)2 Am502 F: CAAATGGCCAAGTTACGACTG R: TTCTGGTAATCCAAACTTATGTGG (TTC)3-(GGA)8, AGA(GGA)2 Am522 F: ATGAGTTTGACCCGACTTGA R: TGCGTAACACGATTATCCT (AAT)3-(AGT)2(GGT)7 Am770 F: CAGAGGTGGCAGATGATGTC R: AAGCCTTTAGTTGGGCGTTC CTC(CAC)5CGC,(CAC)3 3.6.2 Điện di sản phẩm PCR
Lƣu ý: Khi tiến hành nạp gel và gắn lƣợc cần tránh tạo bọt khí trong bản gel và tại các giếng.
Bƣớc1: Rửa các tấm kính(0.75mm) với nƣớc. Lau khô bằng giấy mềm. Rửa lại 2lần bằng cồn 70 oC. Dùng giấy không bụi lau lại thật sạch Lắp các tấm kính vào bộ phận đổ gel điện di đứng vào.
Bƣớc2: Chuẩn bị gel phân tích polyacrylamide(7.5%):
H2O 4.89ml
Tris HCl 1.5M,pH 8.8 2.5ml
Monomer 2.5ml
TEMED 10 μl
10% APS 100 μl
Bơm dịch gel vào bộ phận đổ gel. Thêm iso propanol vào để làm đều mặt gel. Đợi gel đông hoàn toàn (khoảng 20phút), thấm hút dịch isopropanol.
Bƣớc3: Chuẩn bị gel gom polyacrylamide(7.5%):
H2O 2.133ml
Monomer 0.83ml
TEMED 3μl
10% APS 30μl
Bơm dịch gel vào bộ phận đổ gel. Gắn lƣợc tạo giếng. Đợi gel đông hoàn toàn. Tháo lƣợc. Gắn bản gel vào buồng điện di đứng. Chuẩn bị load mẫu điện di.
Bƣớc4: Trộn 10µl mẫu với 10µl loading dye5x (BioRad) rồi nạp vào giếng. Vận hành máy điện di ở 60V, 400A trong 60 phút.
Bƣớc5: Di chuyển gel ra khỏi tấm kính và đem nhuộm ethium bromide trong 15 phút. Rửa lại với TAE 0.5X. Tiến hành chụp gel.
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Quá trình ly trích
Li trích DNA là một bƣớc khởi đầu rất quan trọng, vì nó quyết định sự thành công cho phản ứng PCR sau này. Qui trình li trích DNA theo sơ đồ 3.1 đạt hiệu quả tốt vì DNA li trích có độ tinh khiết cao, không bị lẫn tạp DNA lạ. Dịch trích DNA chứa chất mercaptoethalnol có khả năng phá vỡ thành tế bào rất mạnh. Bƣớc sử dụng Chloroform đƣợc lặp lại 2 lần liên tiếp kết hợp với li tâm đã loại bỏ hết protein và polysaccharide có trong mẫu. Do đó, DNA thu đƣợc tƣơng đối tốt, đảm bảo cho phản ứng PCR xảy ra.
Bƣớc pha tủa và pha loãng mẫu sẽ giúp giảm nồng độ tạp chất còn lẫn trong sản phẩm li trích sau cùng, bƣớc li tâm tiếp theo sẽ giúp thu đƣợc DNA tinh sạch với nồng độ thấp ở khoảng giữa ống và không bị lẫn tạp chất đã lắng xuống đáy ống.
Hình điện di sản phẩm ly trích DNA
Phản ứng PCR qua nhiều thí nghiệm với nhiều quy trình nhiệt độ và thành phần thay đổi đã tìm đƣợc điều kiện thích hợp nhất. Quy trình PCR ở trên là phù hợp và cho kết quả tin cậy.
Do các đoạn DNA thu đƣợc từ sản phẩm PCR có kích thƣớc không quá khác biệt nhau nên sự đa hình rất khó nhận thấy trong sản phẩm khi điện di trên gel thông thƣờng. Vì vậy cần phải tiếp tục phân tích trên máy giải trình tự ABI 3100 để thu đƣợc những kết quả chính xác hơn.
Sau khi tách chiết, mẫu ADN tách chiết từ các mẫu lá thí nghiệm này đƣợc sử dụng để thanh lọc các mồi SSR để tìm đa hình và xem mồi nào có thể đƣợc sử dụng để đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các cá thể Keo lá tràm nghiên cứu. Kết quả thanh lọc các cặp mồi thu đƣợc :
Thanh lọc với cặp mồi Am341: Cá thể số 91 không xuất hiện band. Có sự khác nhau về trọng lƣợng các band giữa các cá thể. Đồng thời có sự biến động về di truyền giữa các cá thể.
Thanh lọc với cặp mồi Am 522: Có thu đƣợc đa hình giữa một số dòng. Cá thể số 142 và 178 có trọng lƣợng phân tử nhỏ hơn các dòng khác.
Thanh lọc với cặp mồi Am 502.
Thanh lọc với cặp mồi Am 770:
Cặp mồi Am 770 cũng có thể sử dụng để nhận biết sự khác biệt giữa các cá thể: cá thể số 8 và 36 không có band.
Tƣơng tự nhƣ mồi Am 770, cặp mồi Am 326 cũng đƣợc dùng để nhận biết cá thể 116, 10, 30, 169 và 134 với các cá thể khác.
Nhƣ vậy 3 cặp mồi Am 326, Am 341 và Am 770 có thể đƣợc sử dụng để phân biệt với các cá thể khác trong thí nghiệm này. Cần thử nghiệm tiếp để tìm đƣợc căp mồi chung cho toàn bộ cá thể nghiên cứu.
Kết quả thanh lọc các mồi SSR trong thí nghiệm này, bƣớc đầu đã cho thấy các mồi đều cho dạng đa hình giữa các cá thể, trong đó mồi Am 341 có thể phân biệt dùng để phân biệt cá thể số 91 (thuộc nhóm sinh trƣởng trung bình) với các cá thể khác. Cặp mồi Am 770 có thể đƣợc dùng để nhận biết cá thể số 8 (thuộc nhóm cá thể có sinh trƣởng nhanh), trong khi mồi Am 326 có thể dùng để nhận biết các cá thể 116, 10, 30, 169 và 134 với các thể khác. Tuy nhiên, cặp mồi Am 326 chỉ có thể sử dụng để tìm hiểu mối quan hệ di truyền giữa các cá thể chứ không sử dụng đƣợc để tìm hiểu mối liên kết của chỉ thị phân tử và tính trạng tăng trƣởng nhanh trong quần thể Keo lá tràm này đƣợc. Những thí nghiệm thanh lọc với các cặp mồi khác còn đang đƣợc tiếp tục tiến hành để phát hiện thêm các cặp mồi có thể dùng để phân biệt giữa các cá thể , đặc biệt là có liên quan đến tính trạng sinh trƣởng nhanh , và có thể đƣợc sử dụng trong công tác chọn giống Keo lá tràm theo hƣớng chất lƣợng với độ chính xác cao.
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận
Từ các kết quả thu đƣợc, chúng tôi rút ra một số kết luận nhƣ sau: Sử dụng lá keo non để ly trích sẽ thu đƣợc lƣợng DNA mẫu tốt nhất.
Kết quả thanh lọc cho thấy cặp mồi Am 341, Am 326 và Am 770 có thể đƣợc sử dụng để tìm hiểu mối quan hệ của các cá thể. Tuy nhiên để sử dụng những chỉ thị này tìm hiểu sự liên hệ với tính trạng tăng trƣởng nhanh thi có thể sử dụng mồi Am 341 và Am 770.
Luận văn thực hiện là một phần trong đề tài lớn với việc ứng dụng chỉ thị phân tử ADN trong chọn giống Keo lá tràm theo hƣớng tăng trƣởng nhanh. Tổng số mồi SSR dự kiến sử dụng là 50 cặp. Tuy nhiên do số kinh phí cấp hàng năm hạn chế nên mỗi năm chỉ đủ kinh phí mua 5-6 cặp mồi và hoá chất thí nghiệm. Vì thế, luận văn chỉ mới thực hiện bƣớc thanh lọc đƣợc trên 9 cặp mồi. Do số cặp mồi thanh lọc còn ít nên việc sử dụng phần mềm NTSYS để phân tích mối quan hệ di truyền sẽ chƣa đƣợc chính xác, vì thế luận văn chƣa thể có kết luận về mối quan hệ di truyền giữa các cá thể nghiên cứu.
5.2 Đề nghị
Trong các công trình nghiên cứu tiếp theo về Microsatellite để mang lại các kết quả khả quan hơn trong việc thu nhận các đoạn DNA mã hoá cho các tính trạng chiều cao cây, thể tích thân, phẩm chất gỗ, khả năng chống chịu sâu bệnh.. cần lƣu ý một số vấn đề sau:
- Tiếp tục áp dụng và hoàn thiện kỹ thuật Microsatellite để lập hồ sơ kiểu gene cho các giống và keo phục vụ cho việc trao đổi dữ liệu, thông tin về đa dạng di truyền giữa các giống, đồng thời phục vụ cho công tác lai tạo và chọn lọc giống.
- Từ kết quả nghiên cứu lần này tiếp tục phát triển thêm, nhiều cặp mồi SSR cần phải đƣợc thử nghiệm, thanh lọc để chọn lựa primer phù hợp hơn cho việc đánh giá mối quan hệ di truyền gữa các cá thể Keo lá tràm một cách chính xác, để xây dựng cơ sở di truyền hoàn chỉnh và tin cậy cho các giống có phẩm chất cao tại Việt Nam nhằm tạo thuận lợi cho những nhận định, kiểm tra, phân tích sau này.
-Cần chú ý thu thập thông tin về các QTL (Quantitive trait loci) có liên quan đến tính trạng tăng trƣởng nhanh để tìm đƣợc những cặp mồi thích hợp cho quá trình phân tích. Trên cơ sở đó, cặp mồi tìm đƣợc sẽ đƣợc dùng để xác định sự liên hệ với các tính trạng tăng trƣởng nhanh ở quần thể Keo lá tràm nghiên cứu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Bùi Chí Bửu – Nguyễn Thị Lang – 1999: Di truyền phân tử - Những nguyên tắc căn bản trong chọn giống cây trồng- Nhà xuất bản Nông nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh.
2. Lê Trọng Cúc – 2002: Đa dạng sinh học và bảo tồn thiên nhiên – Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.
3. Đỗ Thị Hoàng Diễm :Luận văn khóa luận tốt nghiệp 2002-2006.
4. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng – 1997: Sinh học phân tử - Nhà xuất bản giáo dục.
5. Bùi Việt Hải – 1998:Nghiên cứu một số cơ sở khoa học cho kỹ thuật tỉa thƣa rừng trồng Keo lá tràm cung cấp gỗ nguyên liệu giấy sợi vùng miền Đông Nam Bộ.
6. Phạm Thành Hổ : Bài giảng CNSH cây trồng.
7. Nguyễn Thị Lang – 2002: Các phƣơng pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học – Nhà xuất bản Nông nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh.
8. Lâm Vỹ Nguyên: Luận văn khóa luận tốt nghiệp 2002-2006.
9. Phạm Bình Quyền - Nguyễn Nghĩa Thìn – 2002. Đa dạng sinh học - Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.
10. Nguyễn Nghĩa Thìn – 2005: Đa dạng sinh học và tài nguyên di truyền thực vật - Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.
11. Trần Ngọc Việt : Luận văn khóa luận tốt nghiệp 2002-2006.
TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI
13. Butcher PA.; Decroocq S.;Gray Y. và Moran GF.,2000: Development, inheritance and cross- species amplification of Microsatellite markers from Acacia mangium.
14. Wickneswari R and Norwati M 199: Genetic diversity of natural population of Acacia auriculifofmis. Aust.J.Bot. 41:65-77.
15. Kenneth Berendzen, Iain Searle, Dean Ravenscroft, .v.v..,2005: A rapid and versatile combined DNA/RNA extraction protocol and its application to the analysis of a novel DNA marker set polymorphic between Arabidopsis thalian ecotypes Col-0 and Landsberg erecta
16. T. A. Holton, 1999. Plant Genotyping by Analysis of Microsatellites – Centre for Plant Conservation Genetics. Southern Cross University, Lisomore, Australia
17. Powell W; Morgante M; Andre C; Hanafey M; Vogel J; Tingey S; Rafalski A: The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (Microsatellite) markers for germplasm analysis
18. Antonio A.F. Garcia, Luciana L. Benchimo, Antônia M.M. Barbosa, Isaias O. Geraldi: Comparison of RAPD, RFLP, AFLP and SSR markers for diversity studies in tropical maize inbred lines
TRANG WEB http://www.nea.gov.vn/nIndex.asp?ID=22275 http://www.weihenstephan.de/pbpz/bambara/html/rapd.html http://www.ncbi.nih.gov http://www.nea.gov.vn/html/DDSH/dulieu1/khainiem/ http://webdoc.sub.gwdg.de/ebook/y/1999/whichmarker/index.htm
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Danh sách các dòng Keo trong thí nghiệm.
STT Các dòng PT tốt Dòng PT TB Dòng PT chậm Dòng số V(cm3) Dòng số V (cm3) Dòng số V(cm3) 1 12 19.42 70 15.07 177 6.61 2 33 19.6 140 15.1 51 7.58 3 41 19.64 167 15.18 132 7.67 4 30 19.73 99 15.2 176 7.88 5 1b 19.85 94 15.23 104 7.9 6 1c 20.18 138 15.41 151 8.04 7 29 20.8 76 15.42 88 8.08 8 38 20.92 91 15.52 131 8.87 9 159 21.06 67 15.59 178 9.03 10 84 21.11 2 15.6 5 9.09 11 7 21.3 61 16.06 170 10 12 145 21.42 50 16.15 150 10.75 13 25 21.52 72 16.37 144 10.84 14 19 21.54 162 16.42 166 11.21 15 1f 21.59 11 16.48 148 11.32 16 158 21.73 4 16.95 92 11.43 17 9 21.86 10 16.99 47 11.79 18 8 22.51 23 17.22 175 11.82 19 36 23.21 71 17.22 135 12.26 20 3 23.4 65 17.23 103 12.36 21 34 23.76 16 17.25 142 12.48 22 18 24.02 71b 17.49 163 12.6 23 1k 24.27 89 17.66 168 12.75 24 44 24.45 31 17.75 169 12.86 25 57 24.5 137 17.84 136 12.88 26 85 25.16 97 18.02 86 13.26 27 13 25.45 152 18.1 56 13.33 28 1 25.57 78 18.15 73 13.49 29 58 25.82 172 18.22 83 13.56 30 147 26.65 81 18.23 87 13.72 31 64 27.87 60 18.41 82 13.85 32 1e 27.94 133 18.62 100 13.97 33 26 28.08 32 18.64 14 14,16 34 43 29.83