M13 (F/R)
Quá trình biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli bằng
sốc nhiệt có hiệu quả có thể tới 95%. Song rất có thể còn có những gen không đƣợc gắn vào và chúng sẽ tồn tại bên trong hoặc xung quanh những khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trƣờng chọn lọc. Do đó, PCR plasmid với cặp gen đặc hiệu
3’INV, 5’INV vẫn có thể thu đƣợc những băng có kích thƣớc khoảng 435 bp
nhƣng không có đoạn gen Invertase đƣợc gắn vào vector. Vì vậy, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi M13for/rev đặc hiệu của vector pENTR/D với các plasmid của các dòng khuẩn số 1, 2, 3 để có kiểm tra chính xác xem đoạn gen Invertase đã gắn đƣợc vào vector tách dòng hay chƣa. Theo
lý thuyết thì vị trí gắn mồi M13for/rev trên vector pENTR/D đƣợc thiết kế đặc hiệu và cho phép nhân một đoạn DNA từ nucleotide vị trí 537 tới vị trí 861 trên vector pENTR/D. Nhƣ vậy, PCR với cặp mồi này sẽ thu đƣợc các sản phẩm có chiều dài khoảng 750 bp hoặc 324 bp từ các dòng plasmid INV_pENTR dƣơng hoặc âm tính tƣơng ứng khi kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%.
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid với cặp mồi M13(For/Rev) nhằm kiểm tra sự có mặt của đoạn Invertase
trong vector pENTR/D
(M): Marker 1kb; (1), (2),( 3): sản phẩm PCR từ plasmid INV_ pENTR/D; (-): đối chứng âm
Với kết quả thu đƣợc ở hình 3.3 cho thấy rằng 2 dòng plasmid tái tổ hợp tách từ dòng khuẩn số 1 và 2 cho các băng có kích thƣớc khoảng 750 bp đúng với kích thƣớc của tính toán lý thuyết của các dòng plasmid INV_pENTR dƣơng tính. Nhƣ vậy, có thể kết luận rằng đoạn gen Invertase đã đƣợc gắn và tạo “entry clone” INV_pENTR ở dòng khuẩn số 1 và 2. Dòng plasmid INV_pENTR tái tổ hợp đã đƣợc gửi đi để xác định trình tự đoạn gen Invertase.
750 bp