3.1 Nội dung nghiên cứu
3.1.1 Kiểm tra đặc tính sinh học giống virus vacxin tr−ớc khi đ−a vào sản xuất - Khả năng thích ứng và tính ổn định của giống
- Xác định các chỉ số ELD50 và EID50 của giống
3.1.2 Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin nh−ợc độc viêm gan vịt từ chủng virus vacxin DH- EG- 2000
3.1.2.1 Quy trình sản xuất vacxin
3.1.2.2 Kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của vacxin 3.1.2.3 Kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin.
- Kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin tại phòng thí nghiệm. - Kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin ngoài thực tế.
3.1.2.4 Kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vacxin
- Giám định giống virus c−ờng độc viêm gan vịt VG-04 gây bệnh trên thực địa để phục vụ nghiên cứu chỉ tiêu hiệu lực vacxin bằng phản ứng PCR.
- Kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực bằng phản ứng trung hòa trên phôi vịt. - Kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực bằng ph−ơng pháp công c−ờng độc cho vịt nuôi ở phòng thí nghiệm.
- Kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực bằng ph−ơng pháp công c−ờng độc cho vịt nuôi ngoài thực địa.
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học ------ 31
3.1.3 ứng dụng vacxin trong phòng bệnh và can thiệp khi có dịch ở một số
tỉnh miền núi, trung du, đồng bằng 3.2 Nguyên liệu
3.2.1 Giống virus
- Giống virus vacxin nh−ợc độc viêm gan vịt DH-EG-2000 thích nghi trên phôi gà đ−ợc bảo quản ở nhiệt độ - 86OC do bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý (Tr−ờng Đại học Nông nghiệp I) cung cấp.
- Giống virus viêm gan vịt c−ờng độc gây bệnh thực địa VG-04 do bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý (Tr−ờng Đại học Nông nghiệp I) phân lập. Giống virus VG-04 đ2 đ−ợc xác định đặc tính sinh học (Trong đó có ELD50 = 10-21,15/0,1ml; EID50 = 10-23,69/0,1ml; LD50 = 10-15,33/0,5ml)
3.2.2. Cặp mồi
Cặp mồi đặc hiệu Duck HPTypeBF2 và Duck HPTypeBR2 để giám định chủng virus viêm gan vịt c−ờng độc dùng trong phản ứng PCR do Bộ môn Hóa sinh - Miễn dịch - Bệnh lý (Viện thú y quốc gia) cung cấp.
Các hóa chất, vật liệu và thiết bị cần thiết để tiến hành phản ứng RT – PCR. 3.2.3 Phôi gia cầm
- Phôi vịt 12 ngày tuổi khoẻ mạnh từ trứng của đàn vịt bố mẹ khoẻ mạnh ch−a tiêm phòng vacxin viêm gan vịt.
- Phôi gà 10 ngày tuổi, khoẻ mạnh từ trứng của đàn gà bố mẹ khoẻ mạnh. - Trứng vịt của đàn vịt bố mẹ khoẻ mạnh ch−a tiêm phòng vacxin viêm gan vịt.
3.2.4 Động vật thí nghiệm
- Vịt con 2 đến 7 ngày tuổi nở ra từ trứng của đàn vịt bố mẹ khoẻ mạnh ch−a tiêm phòng vacxin viêm gan vịt nuôi tại phòng thí nghiệm và ngoài thực địa.
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học ------ 32
3.2.5 Các trang thiết bị phòng thí nghiệm
- Buồng cấy vô trùng, tủ lạnh, tủ ấm 37oC, tủ sấy, tủ lạnh - 86oC, nồi hấp −ớt, nồi đun cách thuỷ, máy ly tâm, máy ảnh.
- Đèn soi trứng, khay đựng trứng, bút chì mỡ. - Dùi trứng.
- Các dụng cụ thí nghiệm khác dùng trong nghiên cứu virus (tất cả đ−ợc rửa sạch, sấy khô ở 1800C/30 phút)
- N−ớc sinh lý 0,9% hấp ở 1 atm/30 phút, bông cồn 700C, bông cồn iod. Formol 10%, glycerin 50%, parafin, đèn cồn.
- Kháng sinh: Penicilline, Streptomycine. - Bình inox lạnh 25 dm3 (vận chuyển vacxin).
3.3 Ph−ơng pháp nghiên cứu
3.3.1 Kiểm tra đặc tính sinh học giống virus vacxin tr−ớc khi đ−a vào sản xuất
3.3.1.1 Ph−ơng pháp xác định khả năng thích ứng và tính ổn định của giống virus vacxin nh−ợc độc DH - EG - 2000.
Xác định khả năng thích ứng và tính ổn định của giống bằng ph−ơng pháp cấy truyền đời virus trên phôi gà 10 ngày tuổi.
- Bố trí thí nghiệm: Chuẩn bị 120 phôi gà 10 ngày tuổi chia đều thành 4 lô, trong đó có 3 lô thí nghiệm và 1 lô đối chứng.
Virus đ−ợc pha thành huyễn dịch có nồng độ 10-2 tiêm vào xoang niệu mô, liều tiêm 0,2 ml/phôi.
- Cách thức tiến hành:
+ Chuẩn bị trứng gà giống (trứng của đàn gà bố mẹ khoẻ mạnh). + ấp trứng ở tủ ấp (370C) đến ngày thứ 10, lấy trứng ra soi, chọn những trứng có phôi khoẻ mạnh, đánh dấu buồng hơi và vị trí đầu phôi.
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học ------ 33
+ Chuẩn bị chủng virus vacxin: Chủng virus vacxin DH - EG - 2000 ở dạng đông khô, đ−ợc giải đông và pha với n−ớc muối sinh lý 0,9% thành nồng độ 10-2. Những lần cấy chuyển tiếp theo, dùng n−ớc trứng thu đ−ợc ở những phôi có bệnh tích điển hình của bệnh viêm gan virus ở vịt.
+ Cách tiêm (tiến hành trong buồng cấy vô trùng): sát trùng toàn bộ vỏ trứng bằng cồn 700, sát trùng buồng hơi bằng cồn Iod 5%. Dùng dùi đục trứng dùi một lỗ nhỏ ở đỉnh buồng hơi. Khi tiêm, đ−a kim qua lỗ dùi chếch về phía đầu phôi, sâu khoảng 1,5 - 2 cm thì bơm từ từ 0,2 ml huyễn dịch đ2 pha vào xoang niệu mô, hàn lỗ bằng parafin. Cho trứng vào tủ ấp tiếp ở 370C.
Trứng ở lô đối chứng không tiêm hỗn dịch.
Sau khi tiêm, hàng ngày soi trứng để kiểm tra phôi, ghi giờ phôi chết. Những phôi chết cho vào tủ lạnh để ở nhiệt độ 40C/24 giờ. Theo dõi trứng đến 96 giờ. Loại bỏ những phôi chết tr−ớc 24 giờ. Mổ trứng: lấy trứng ra khỏi tủ lạnh, lau khô, sát trùng toàn bộ vỏ trứng bằng cồn 900, sát trùng buồng hơi bằng cồn iod 5%. Dùng kéo cong cắt phần vỏ của buồng hơi, thu n−ớc trứng, xử lý kháng sinh, đóng vào từng ampoul 1ml, bảo quản ở -280C. Gắp phôi ra đĩa lồng để quan sát bệnh tích đại thể của phôi (so sánh với phôi đối chứng).
3.3.1.2 Ph−ơng pháp xác định chỉ số ELD50 (Embryo lethal dose fifty percent)
- Chuẩn bị phôi gà: Trứng gà giống đem ấp ở 370C đến ngày thứ 9 thì soi và chọn trứng có phôi khoẻ, đánh dấu buồng hơi và vị trí đầu phôi. Tr−ớc khi tiêm trứng, sát trùng toàn bộ vỏ trứng bằng cồn 900, sát trùng buồng hơi bằng cồn iod 5%. Cách tiêm nh− phần 3.3.1.1.
- Chuẩn bị giống virus vacxin: Giống virus vacxin dùng trong thí nghiệm này là n−ớc trứng của những phôi chết sau 24 h trong lần thí nghiệm kiểm tra tính ổn định của giống đ2 đ−ợc đóng trong ampoul 1ml bảo quản ở tủ lạnh - 280C. Giống virus đ−ợc pha với n−ớc sinh lý theo cơ số 10 nồng độ, từ 10-1 đến 10-7. Xử lý kháng sinh. Mỗi nồng độ tiêm cho 6 phôi, liều tiêm 0,2
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học ------ 34
ml/phôi; vị trí tiêm xoang niệu mô.
Riêng 6 phôi đối chứng không tiêm virus.
- Theo dõi: theo dõi phôi hàng ngày đến 96 h, lấy các phôi chết cho vào tủ lạnh ở nhiệt độ 40C trong 24 giờ. Mổ trứng và quan sát bệnh tích của phôi so sánh với phôi đối chứng.
Ghi số phôi chết có bệnh tích và số phôi sống ở mỗi nồng độ.
Tính toán liều gây chết tối thiểu 50% phôi (ELD50) theo công thức của Reed - Muench. LgELD50 = LgA + XLgf B A A X ′ − ′ ′ − = 50 X - Khoảng cách tỷ lệ
A - Độ pha lo2ng virus gây chết phôi cận trên 50% A' - Tỷ lệ chết phôi cận trên 50%
B' - Tỷ lệ chết phôi cận d−ới 50% f – Bậc pha lo2ng virus
- Tiến hành 3 đợt thí nghiệm nh− trên, tính chỉ số ELD50 trung bình.
3.3.1.3 Ph−ơng pháp xác định chỉ số EID50 (Embryo infective dose fifty percent)
- Chuẩn bị phôi trứng gà, giống virus, cách thức bố trí thí nghiệm và tiêm trứng giống nh− thí nghiệm để xác định chỉ số ELD50 ở phần 3.3.1.2.
- Theo dõi: sau khi tiêm trứng, theo dõi phôi hàng ngày đến 96 giờ, lấy các phôi chết cho vào tủ lạnh ở nhiệt độ 40 C trong 24 giờ.
- Mổ trứng: sau 96 giờ đem mổ tất cả trứng ở lô thí nghiệm và lô đối chứng để quan sát bệnh tích của phôi.
- Ghi số phôi có bệnh tích, không có bệnh tích (so sánh với phôi đối chứng) ở mỗi nồng độ pha lo2ng giống virus.
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học ------ 35
Bệnh tích cần theo dõi để đánh giá là nhiễm virus: phôi xuất huyết, phù phôi, gan phôi xuất huyết.
- Tính toán liều gây nhiễm tối thiểu 50% phôi (EID50) theo công thức của Reed - Muench.
3.3.2 Nghiên cứu qui trình sản xuất vacxin viêm gan vịt nh−ợc độc từ chủng virus vacxin DH - EG - 2000
3.3.2.1 Qui trình sản xuất vacxin
- Chuẩn bị phôi gà: trứng gà giống đ−ợc chọn từ trứng của đàn gà bố mẹ khoẻ mạnh đem ấp trong tủ ấm 370C đến ngày thứ 10. Lấy ra chọn những phôi khoẻ mạnh.
- Chuẩn bị giống virus: giống virus vacxin là n−ớc trứng của những lần thí nghiệm kiểm tra tính ổn định và thích nghi trên phôi gà 10 ngày tuổi ở phần 3.3.1.1. Pha n−ớc trứng với n−ớc sinh lý thành nồng độ 10-2, xử lý kháng sinh.
- Tiêm trứng (cách làm t−ơng tự phần 3.3.1.1). Theo dõi đến 96 giờ sau khi tiêm. Chỉ thu những phôi chết và sống trong khoảng 48-96 giờ. Giữ trong tủ lạnh 40C/24 giờ để mạch máu co lại.
- Thu hoạch vacxin cho vào bình cầu lớn bảo quản ở -200C. Kiểm tra các chỉ tiêu vô trùng, an toàn, hiệu lực. Nếu đạt các chỉ tiêu trên thì tiến hành đóng vào ampoul 1 ml bảo quản ở - 200C.
3.3.2.2 Ph−ơng pháp kiểm tra chỉ tiêu vô trùng
Tiến hành 3 thí nghiệm với lô vacxin vừa sản xuất.
ở mỗi thí nghiệm cấy lần l−ợt vào từng môi tr−ờng n−ớc thịt, thạch th−ờng, thạch máu, n−ớc thịt gan yếm khí và thạch nấm (Sabouraud) 0,2 ml vacxin một môi tr−ờng. Mỗi môi tr−ờng 3 ống. Cấy xong cho vào tủ ấm 370C/ 24 ữ48 giờ, lấy ra kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn; môi tr−ờng n−ớc thịt và
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học ------ 36
n−ớc thịt gan yếm khí nếu không có vẩn đục thì đ−ợc coi là không có vi khuẩn. Riêng môi tr−ờng thạch nấm để ở nhiệt độ phòng (25 0C ữ 300C) từ 5
ữ7 ngày mới kiểm tra xem nấm có mọc không.
3.3.2.3. Ph−ơng pháp kiểm tra chỉ tiêu an toàn
- Tại phòng thí nghiệm của bộ môn:
Tiến hành thí nghiệm trên 4 lô vịt con khoẻ mạnh 5 ngày tuổi nuôi tại bộ môn Vi sinh vật- Truyền nhiễm- Bệnh lý, trong đó có 3 lô thí nghiệm và 1 lô đối chứng. Mỗi lô có 10 con.
+ Lô 1: 10 con, tiêm vacxin d−ới da, liều tiêm bằng liều sử dụng 10-2/0,5ml (t−ơng đ−ơng 300 ELD50)
+ Lô 2: 10 con, tiêm vacxin d−ới da, liều tiêm bằng 10 liều sử dụng (10-1/0,5ml t−ơng đ−ơng 3000 ELD50).
+ Lô 3: 10 con, tiêm vacxin d−ới da, liều tiêm có khối l−ợng tăng gấp đôi lô 2 (10-1/1ml, t−ơng đ−ơng 6000 ELD50).
+ Lô 4: 10 con đối chứng, không tiêm vacxin.
Theo dõi phản ứng cục bộ và toàn thân sau khi tiêm đến 3 ngày. Tiếp tục theo dõi các trạng thái sinh lý: ăn, đi lại, tốc độ sinh tr−ởng đến 20 ngày tuổi. So sánh trạng thái sinh lý với vịt đối chứng để kết luận.
- Ngoài thực tế:
Bố trí tiêm vacxin vừa sản xuất cho các đàn vịt nuôi ngoài thực địa thuộc tỉnh Hải D−ơng, Bắc Giang và Lạng Sơn. Tiêm d−ới da vùng cổ với liều tiêm 10-2/0,5ml/con, t−ơng đ−ơng 300 ELD50. Theo dõi các chỉ tiêu nh− trong phòng thí nghiệm.
3.3.2.4 Ph−ơng pháp kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vacxin
3.3.2.4.1 Giám định giống virus c−ờng độc viêm gan vịt VG-04 gây bệnh thực địa
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học ------ 37
- Địa điểm thí nghiệm: Bộ môn Hoá sinh - Miễn dịch - Bệnh lý (Viện thú y quốc gia).
- Chuẩn bị mẫu virus: N−ớc trứng của lần cấy chuyển virus viêm gan vịt c−ờng độc VG-04.
- Cặp mồi (Primer) đặc hiệu sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm: Mồi xuôi Duck HPBF2 (5/ GCC CGT GGG GAT GCC CAG GA 3/)
Mồi ng−ợc Duck HPBR2 (5/ CAG GGG CAG TAG TGA AGA GA 3/)
Cặp mồi này đ−ợc tổng hợp dựa trên cơ sở trình tự gen của virus viêm gan vịt đ2 công bố trên ngân hàng gen (www.ncbi.nlm.nih.gov), căp mồi này bám đặc hiệu lên vùng gen RNA polymerase của hệ gen của virus viêm gan vịt TypeB typeI. Sản phẩm PCR thu đ−ợc sẽ có độ dài là 182 bp.
- Ph−ơng pháp tiến hành + Chiết tách RNA
N−ớc trứng bảo quản ở - 860C đem giải đông. Lấy từ mỗi mẫu 100àl + 0,9 ml trizol.
Tách pha RNA: giữ 1 ml huyễn dịch n−ớc trứng-trizol ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Lắc mạnh (15 giây) và giữ lại ở nhiệt độ phòng trong 3 phút. Ly
tâm 11400 vòng/phút ở máy ly tâm Eppendorf 5415 R trong 15 phút (280C).
Chuyển pha n−ớc bên trên sang ống Eppendorf (500àl pha trên).
Tủa RNA: thêm 500àl isopropyl alcohol vào huyễn dịch RNA-trizol,
lắc trộn đều trên máy Vortex. Giữ dung dịch ở 300C trong 10 phút. Ly tâm 11400 vòng/phút trên máy ly tâm Eppendorf 5415R trong 10 phút. Bỏ dịch trên, thu cặn RNA.
Rửa cặn RNA: thêm 1 ml alcohol 70%, trộn lắc bằng máy Vortex. Ly tâm 9000 vòng/phút bằng máy ly tâm Eppendorf 5415R ở 40C trong 5 phút. Bỏ dịch trên, thu cặn RNA, ly tâm lại, dùng pipette loại bỏ đến giọt cồn cuối cùng.
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học ------ 38
Làm khô và hoà tan RNA. Làm khô cặn RNA bằng cách để trên bàn, mở nắp ống trong 15 phút. Hoà tan RNA trong 15àl Rnate free - Water bằng
pipet, trộn lắc bằng máy Vortex. Giữ trên đá lạnh nếu dùng ngay hoặc bảo