2. TỔNG QUAN TÀI LIỆ U
2.2.3. Cơ chế gõy ủộ t biến
Theo lý thuyết của A.M.Kuzin cơ chế của quỏ trỡnh gõy ủột biến gồm 3 giai ủoạn chớnh: Tia X 6 % Kết hợp 1 % Hoỏ học 10 % Nuụi cấy mụ 11 % Tia Gamma 72 %
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 16 - Giai ủoạn 1: Cú tớnh chất vật lý, sự tương tỏc của bức xạ tạo ra cỏc quỏ trỡnh ion hoỏ và sự biến ủổi cỏc hợp chất ở mức dưới phõn tử và phõn tử.
- Giai ủoạn 2: Cú tớnh chất hoỏ học, ở giai ủoạn này diễn ra cỏc phản
ứng tương tỏc của cỏc sản phẩm sơ cấp do kết quả tương tỏc của bức xạ với cỏc ủại phõn tử chưa bị biến tớnh của cấu trỳc sinh học, tạo ra cỏc peoxit hữu cơ ủồng thời diễn ra cỏc phản ứng oxi hoỏ dẫn tới sự tạo thành một số hợp chất mới và cỏc gốc ủộc tớnh.
- Giai ủoạn 3: Cú tớnh chất sinh học, là giai ủoạn phỏt huy tỏc dụng của cỏc phản ứng lờn hoạt ủộng của cỏc tế bào sống. Tức là cỏc biến ủổi hoỏ học gõy nờn do bức xạ dưới mức tế bào trở thành cỏc biến ủổi trong cỏc tổ chức của tế bào, chẳng hạn làm thay ủổi cấu trỳc và tớnh thấm của màng tế bào.
Những biến ủổi này dẫn tới sự giải phúng một số enzym và hoạt hoỏ tỏc
ủộng của cỏc enzym này. Sự hoạt ủộng của cỏc enzym mở ủầu cho một chuỗi cỏc phản ứng tổng hợp chất quan trọng cho hoạt ủộng và phõn chia tế bào như
tổng hợp ATP, ADN và cỏc protein cần thiết.
Quỏ trỡnh tỏc ủộng qua nhiều giai ủoạn như thế gọi là tỏc ủộng giỏn tiếp của bức xạ lờn tế bào sống. Ngoài ra, cỏc nghiờn cứu cho thấy cỏc tia bức xạ
cũn gõy ra trực tiếp lờn một số cấu trỳc dưới tế bào gõy ảnh hưởng trực tiếp
ủến quỏ trỡnh tổng hợp ADN và tổng hợp protit trong tế bào sống, ủặc biệt là cỏc biến ủổi trong cấu trỳc ADN, làm phỏt sinh ủột biến di truyền. Tỏc dụng trực tiếp của bức xạủược giải thớch khỏ thành cụng nhờ lý thuyết bắn bia của sinh học phúng xạ [11].
Với phương phỏp ủột biến thực nghiệm, sử dụng cỏc tỏc nhõn gõy ủột biến hoỏ, lý ủó làm tăng sự sai khỏc về mặt di truyền trong quần thể. Trong hàng loạt ủột biến xuất hiện, bờn cạnh những ủột biến cú hại, cũn cú những
ủột biến cú lợi. Chỳng cú thể nhõn trực tiếp thành giống mới hoặc sử dụng làm vật liệu khởi ủầu cho cụng tỏc tạo giống [4].
Tớnh ủến thỏng 7/2006 (dữ liệu của FAO/IAEA mutant varieties database) cú 2428 giống cõy trồng ủược tạo ra bằng phương phỏp gõy ủột biến trong ủú chiếu xạ chiếm 88,8%.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 17 Quỏ trỡnh tạo ra ủột biến là một quỏ trỡnh phức tạp ủược chỳng tụi minh hoạ bằng sơủồ dưới ủõy:
Sơủồ minh họa tỏc dụng trực tiếp của bức xạ [11]
2.2.4. Cơ sở khoa học của tạo giống cõy trồng ủột biến in vitro
Sơủồ nuụi cấy khụng cú mụ phõn sinh:
Mụ → Mụ sẹo (callus) → Cụm chồi → Ra rễ→ Cõy hoàn chỉnh[15]
Tác nhân (n,h,γ)
- Các phản ứng hoá học của các gốc làm xuất hiện phản ứng dây truyền. - Sự dịch chuyển của các ion
Gây sai hỏng cấu trúc ở mức phân tử và d−ới phân tử
Sự biến đổi các cấu trúc lý hoá của các cấu trúc sinh học (tắnh thấm,
tắnh hấp thụ, trật tự cấu trúc.
Các hiệu ứng sinh lý ban
đầu
Sự thay đổi hoạt tắnh và tác dụng phối hợp của các enzym
Sự biến đổi các enzym và các polyme sinh học Tổng hợp ADN Tổng hợp Protit Các PƯ traođổi Tạo thành các dạng độc tố
Tạo ra các đột biến Những biến đổi suy yếu
Sự photphorin hoá các axit Làm chậm phân chia tế bào Di chuyển năng l−ợng Thay đổi trạng thái điện tắch, tắnh thấm của tế bào. H2O OH H2O2 H HO2 RH RCOOH
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 18 Trong quỏ trỡnh nuụi cấy thỡ giai ủoạn callus là một tổ chức mụ vụ tớnh mà từủú cỏc cõy con ủược phỏt triển từ một tế bào, nếu ủột biến ở giai ủoạn callus thỡ tần số xuất hiện ủột biến sẽ rất cao vỡ ở giai ủoạn callus rất mẫn cảm với cỏc yếu tố bờn ngoài như (nhiệt ủộ, ỏnh sỏng, yếu tố vật lý, hoỏ họcẦ), khi cỏc callus ở trạng thỏi hợp tửủơn bào mà xảy ra ủột biến thỡ qua giai ủoạn phõn chia nguyờn nhiễm sẽ tạo ra một cơ thể cú sựủồng nhất về kiểu gen mà ớt cú hiện tượng khảm. đú là sự khỏc biệt giữa việc gõy ủột biến thực nghiệm callus với ủột biến thực nghiệm mầm hoặc chồi, bởi việc gõy ủột biến thực nghiệm mầm hoặc chồi dễ tạo ra cỏc thể khảm (khảm là hiện tượng cú hai hay nhiều kiểu gen cựng tồn tại). Hơn nữa, ủột biến mầm hoặc chồi thỡ khả năng tạo ra ủột biến ủồng nhất là rất khú, hoặc nếu cú ủược những thể khảm rồi sau
ủú phải tiếp tục nhõn ủể tỏch dũng ủột biến ủồng nhất là một cụng việc rất lõu dài và khú khăn.
Vỡ vậy, kỹ thuật gõy ủột biến kết hợp với nuụi cấy in vitro ủó ủược ỏp dụng ủối với cõy nhõn giống vụ tớnh nhờ tiềm năng rất lớn về nhõn số lượng cõy trong in vitro khụng cần thời gian dài, cú thể rỳt ngắn ủược chu kỳ chọn lọc ủột biến, nhanh chúng ủưa sản phẩm ra phục vụ sản xuất.
2.2.5. Cỏc nghiờn cứu và ứng dụng về chọn tạo giống bằng ủột biến và ủột biến phúng xạở trong và ngoài nước
2.2.5.1. Cỏc nghiờn cứu và ứng dụng về chọn tạo giống bằng ủột biến và ủột biến phúng xạ trờn thế giới
Từ những năm 1970 trở lại ủõy, trờn thế giới, nhiều phũng thớ nghiệm khỏc nhau ở cỏc nước ủó tiến hành việc nghiờn cứu thực nghiệm: Nghiờn cứu về cơ chế phõn tử của quỏ trỡnh ủột biến (Dubinin, 1970, 1979, 1985;
Taraxov, 1975, 1979, 1990, 1992; Nguyễn Hữu đống, 1978, 1982, 1989Ầ),
cũng như việc ứng dụng nú trong cụng tỏc chọn giống cỏc loại cõy trồng nụng nghiệp (ngụ, lỳa, lỳa mỡ, ủậu, lạc, hoa, cõy cảnhẦ) và thu ủược nhiều kết quả
to lớn. Một vài nghiờn cứu gõy tạo biến dị bằng chiếu xạ ở chuối in vitro
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 19 Ahloowalia, 1990).
Theo FAO/IAEA thỡ số lượng cỏc cõy trồng mới ủược tạo ra bằng phương phỏp ủột biến cảm ứng (bằng cỏc nhõn tố vật lý hoặc bằng cỏc nhõn tố hoỏ học, hoặc bằng sự phối hợp giữa cỏc nhõn tố vật lý và hoỏ học) cựng với việc sử dụng cỏc phương phỏp chọn giống cổủiển như lai tạo, chọn lọc cỏ thể, chọn lọc hàng loạtẦ ủó tăng lờn nhanh chúng. Theo thống kờ của FAO, năm 1960 chỉ cú 7 giống cõy trồng ủột biến trờn thế giới thỡ ủến năm 1980 cú 500 giống, năm 1990 cú 1970 giống (Nguyễn Hữu đống, 2000) [30]. Nhiều giống lỳa mang tớnh trạng quý ủó ủược tạo nờn do ủột biến như: Nửa lựn (126 giống), chớn sớm (110 giống), chất lượng hạt cao (16 giống), chịu mặn (9 giống)Ầ[26].
Tại hội nghị di truyền quốc tế (1993) Sidoro và Morgun ủó cụng bố
việc tạo thành cụng 2 giống lỳa mỡ mựa ủụng thụng qua biến dị tỏi sinh từ
callus và chiếu xạ tia gamma lờn hạt [12].
đến năm 2006, ủó cú trờn 2541 giống cõy trồng ủột biến thuộc 169 loài trong ủú phần lớn là ủột biến phúng xạủó ủược ỏp dụng trong sản xuất (IAEA Database, 2006). đến thỏng 7/2007, ủó cú trờn 2600 giống cõy trồng ủột biến trong ủú phần lớn là ủột biến phúng xạủó ủược ỏp dụng trong sản xuất, ủược thể hiện qua biểu ủồ sau: 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 1966 1971 1976 1981 1986 1991 1996 1999 2002 2007
Biểu ủồ 2: Số lượng cõy trồng ủược tạo ra nhờ gõy ủột biến trờn thế giới
Số l−ợng giống
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 20 Cỏc giống cõy trồng ủột biến ủược tạo ra ở cỏc chõu lục cũng khỏc nhau, ủược thể hiện qua biểu ủồ sau :
Biểu ủồ 3: Giống cõy trồng ủột biến ủược tạo ra ở cỏc chõu lục Chương trỡnh liờn kết FAO/IAEA về lương thực và nụng nghiệp hiện nay mỗi năm ủầu tư 20 triệu Euro ủể thực hiện 140 dự ỏn quốc gia và khu vực, thu hỳt trờn 400 Viện và Trạm thực nghiệm tham gia nghiờn cứu phối hợp trong chương trỡnh Nụng nghiệp hạt nhõn.
Tại Trung Quốc từ năm 1950 ủến nay ủó thu hỳt trờn 18 Viện, Trường lớn với khoảng 1200 nhà khoa học hỡnh thành mạng lưới nghiờn cứu, ứng dụng về nụng nghiệp hạt nhõn một cỏch cú hiệu quả. Hầu hết cỏc nước trong khu vực Asean ủều ủó thành lập cỏc Trung tõm ứng dụng kỹ thuật hạt nhõn trong nụng nghiệp. đến năm 1999, Trung Quốc thu 3,3 tỷ Nhõn dõn tệ từ ỏp dụng giống ủột biến phúng xạ.
Hơn 60% giống cõy trồng ủột biến ủược tạo ra sau 1985-thời kỡ cụng nghệ
sinh học ủược ứng dụng mạnh mẽ trong chọn giống cõy trồng
200 400 600 800 1000 1200 Giống cõy trồng ủột biến ủược tạo ra ở cỏc chõu lục 0 Africa Asia Australia Europe L. Amer. North Amer. 48 1142 7 847 48 160 FAO/IAEA Mutant Varieties Database
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 21 Theo tớnh toỏn của Viện Chọn giống phúng xạ Nhật Bản (2006), ủầu tư
1 USD cho nghiờn cứu ứng dụng hạt nhõn trong chọn tạo giống cõy trồng sẽ
thu lại lợi nhuận 1000 USD.
Pakistan cú 70% diện tớch trồng bụng ủột biến phúng xạ.
Tại chõu Á, ủó thành lập Hiệp hội chọn giống ủột biến do Nhật Bản tài trợ. Năm 1996, Việt Nam ủó trở thành thành viờn chớnh thức của Hiệp hội và Viện Di truyền Nụng nghiệp ủược chỉủịnh làm cơ quan ủầu mối. đõy là một cơ
hội thuận lợi ủể cỏc nước trong khu vực núi chung và Việt Nam núi riờng cú
ủiều kiện hợp tỏc, trao ủổi thụng tin, ủào tạo cỏn bộ trong lĩnh vực khoa học này.
2.2.5.2. Cỏc nghiờn cứu và ứng dụng về chọn tạo giống bằng ủột biến và ủột biến phúng xạở trong nước
Trong cụng tỏc chọn tạo giống cõy trồng, một trong những hướng quan trọng ủể tạo ra cõy tam bội, ủặc biệt ủối với cõy cú mỳi như: Cam, quýt, bưởiẦ là dựng phộp lai giữa giống nhị bội và giống tứ bội. Tuy nhiờn cụng tỏc này vẫn cũn hạn chế bởi sự thiếu nguồn gen tứ bội, do vậy việc sử dụng cỏc tỏc nhõn gõy tứ bội hoỏ kiểu gen cõy trồng rất ủược chỳ trọng trong ủú colchicine cú hiệu quả khỏ cao. Một trong những hướng nghiờn cứu của nhiều phũng thớ nghiệm trờn thế giới là sử dụng cỏc kỹ thuật tạo tứ bội thể khỏc nhau như: Xử lý colchicine trờn cành, mắt ghộp, chồiẦ ngoài tự nhiờn hoặc xử lý chồi, mụ sẹo in vitro hoặc tạo dũng tứ bội từ dung hợp tế bào trần nhị
bội với nhau.
Năm 2004, Nguyễn Thị Phương Thảo và cộng sự tại trường đại học Kyushu - Nhật Bản ủó tạo thành cụng dũng tứ bội trờn cõy Alocasia ì
amazonica nhị bội (2n = 28) bằng colchicine và oryzalin. Kết quả thu ủược cho thấy, khi xử lý colchicine nồng ủộ 0,05% trong 72 giờ cho tỷ lệ dũng tứ
bội cao nhất (20%). đối với mẫu xử lý bằng oryzalin tỷ lệ dũng tứ bội cao nhất ở nồng ủộ 0,05% trong 48 giờ. Bờn cạnh ủú, hầu hết trờn cỏc cụng thức cú xử lý colchicine hoặc oryzalin ủều xuất hiện dũng tứ bội ngoại trừ nồng ủộ
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 22 Năm 2005, Hà Thị Thuý và cộng sự của Viện Di truyền Nụng nghiệp
ủó nghiờn cứu ủặc ủiểm sinh học của tớnh trạng khụng hạt và tạo thành cụng dũng tứ bội trờn cõy cam xó đoài, cam Võn Du bằng xử lý colchicine chồi của cỏc giống này. Bờn cạnh ủú tỏc giả cũn tạo thành cụng dũng tứ bội của cõy quýt Chum, bưởi và cam Phỳc Trạch từ xử lý colchicine trờn cành in vivo, xử
lý thành cụng trờn hạt của cõy cam Sành, cõy bưởi đỏẦ[22].
Bờn cạch việc sử dụng colchicine trong xử lý ủột biến tạo dũng tứ bội, nhiều kết quả nghiờn cứu cũn cho thấy hiệu quả gõy ủột biến với tần số tương
ủối cao của tia gamma mà nguồn sử dụng chớnh ủể chiếu xạ là Co60
ủối với một số cõy trồng như: Cõy lỳa, cõy ngụ, cõy ủậu tương, cõy hoa cỳcẦ.
Nhờ việc sử dụng tia gamma, người ta ủó thu ủược nhiều dạng ủột biến cú giỏ trị ở nhiều loại cõy trồng khỏc nhau. Vớ dụ như ở họ hoà thảo ủó thu
ủược những dạng rơm ngắn, chống ủổ, cú khả năng sinh trưởng mạnh, chống chịu tốtẦ Chiếu xạ kết hợp với nuụi cấy in vitro ủó ủược chứng minh là phương phỏp cú giỏ trị ủể tạo ra cỏc biến dị mong muốn và nhõn giống một cỏch nhanh chúng.
Ở Việt Nam, cỏc nghiờn cứu và ứng dụng của phương phỏp gõy ủột biến thực nghiệm và chọn giống thực vật ủó ủược bắt ủầu khỏ sớm. Năm 1966, Bộ mụn Di truyền giống, đại học Tổng hợp Hà Nội bắt ủầu nghiờn cứu trờn cõy lỳa và cõy ủậu tương. Sau ủú hướng nghiờn cứu này ủược triển khai ở
một số cơ sở như: Viện Khoa học kỹ thuật nụng nghiệp, Viện Cõy lương thực và Thực phẩm, Viện Di truyền nụng nghiệp, Trường đại học Sư phạm Hà Nội, đại học Nụng nghiệp Hà NộiẦ. Trong ủú cú một vài tỏc giả ủó thành cụng về tạo giống lỳa ủột biến trờn lỳa như: Vũ Tuyờn Hoàng 1982, Nguyễn
Minh Cụng và cs 1995, 1996, 1999, Trần Duy Quý 1978, 1999; trờn ngụ cú
Nguyễn Hữu đống và cs 1997, 1998, 2000; đặng Văn Hạnh và cs 1994; trờn cõy ủậu tương cú cỏc tỏc giả như: Trần đỡnh Long 1980; Vừ Hựng và cs 1982 Ầ
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 23 Trong 20 năm trở lại ủõy, nước ta ủó ủó thu ủược nhiều thành tựu ủỏng kể trong việc nõng cao sản lượng lương thực, ủặc biệt là lỳa nhờ phương phỏp gõy ủột biến thực nghiệm. Từ năm 1989 Ờ 2000, Viện Di truyền Nụng nghiệp
ủó cụng bố 6 giống lỳa quốc gia: DT 10, DT 11, DT 13, DT 33, DT 16 và Nếp thơm DT 21. Năm 2003, Lờ Xuõn đắc, Bựi Văn Thắng và cộng sự thuộc Viện Cụng nghệ Sinh học, Trung tõm Khoa học tự nhiờn và Cụng nghệ Quốc gia ủó tiến hành nghiờn cứu ảnh hưởng của tia gamma (Co60) ủến khả năng sống sút và tỏi sinh cõy từ mụ sẹo trờn một số giống lỳa ủịa phương. Kết quả cho thấy, liều chiếu xạ thớch hợp cho mụ sẹo của 4 giống (Tỏm Xoan, Tỏm ấp bẹ, Dự
thơm, Tẻ Di Hương) từ 7 Krad ủến 9 Krad. Tỏc giả tiến hành chiếu xạ với cỏc liều chiếu khỏc nhau trờn 6000 khối mụ sẹo và ủó thu ủược 1271 dũng cõy, một số dũng ở MR0 ủó cú biểu hiện thấp cõy ủang ủược cỏc tỏc giả nghiờn