CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.3.1.Phương pháp tách chiết DNA plasmid
Tách chiết và tinh sạch DNA plasmid là một bước thí nghiệm quan trọng trong các nghiên cứu nhân dòng phân tử cũng như trong hàng loạt nghiên cứu khác của lĩnh vực sinh học phân tử. Các plasmid thường được tinh sạch từ môi trường nuôi cấy dịch thể được chuẩn bị bằng cách nuôi cấy một khuẩn lạc đơn mang plasmid (thể biến nạp). Có nhiều phương pháp được sử dụng hiện nay để tách chiết DNA plasmid như sử dụng các loại Sol, sử dụng TELT, tách bằng kit chuyên dụng. Các phương pháp này cho phép thu nhận chế phẩm DNA plasmid ở dạng tương đối tinh sạch. Phương pháp được sử dụng ở đây là tách DNA plasmid bằng các loại Sol.
Nguyên lý của phương pháp: dựa vào lợi thế của việc biến tính bằng kiềm đối với DNA plasmid và DNA nhân và sự hồi tính một cách chọn lọc DNA plasmid sau khi trung hòa dung dịch.
Các bước tiến hành:
- Bướ 1: Thu cặn tế bào
▪ Hút 1,5ml dịch nuối cấy vào ống eppendorf
▪ Ly tâm 12000 vòng/phút trong vòng 1 phút, loại dịch, thu cặn tế bào
▪ Ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút, loại cạn dịch - Bước 2: Phá tế bào và loại trừ protein
▪ Bổ sung 150µl dung dịch Sol I, vortex để hòa tan hoàn toàn căn tế bào
▪ Sau đó bổ sung 150µl dung dịch Sol II, đảo nhẹ nhàng 3 lần ▪ Bổ sung 150µl dung dịch Sol III, đảo nhẹ nhàng
▪ Thêm 450µl clorofom : phenol : isoaminalcohol tỷ lệ 25:24:1, chiết ở nhiệt độ phòng (RT)
▪ Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. - Bước 3: Tủa DNA plasmid
▪ Hút 400µl dịch nổi chuyển sang ống mới
▪ Bổ sung 400µl isopropanol giữ ở -20oC trong 3 phút ▪ Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút
▪ Loại dịch thu DNA plasmid - Bước 4: Rửa DNA plasmid
▪ Bổ sung 400 µl ethanol 70% ly tâm 13000 vòng/phút
▪ Hòa tan DNA plasmid trong 30µl H2O + RNAse đảo nhẹ, spin ▪ Bảo quản ở 4°C/-20°C