3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
3.3.1. Cỏch bố trớ thớ nghiệm:
Thớ nghiệm 1: Nghiờn cứu ảnh hưởng của cỏc liều lượng chiếu xạủến khả
năng sống, sinh trưởng và tạo biến dị của mẫu cấy. Giống Liều chiếu xạ Cẩm chướng trắng Cẩm chướng ủỏ ð/C (Khụng chiếu xạ) CT1 CT1 1Krad CT2 CT2 2Krad CT3 CT3 3Krad CT4 CT4 4Krad CT5 CT5 5Krad CT6 CT6
Vật liệu thớ nghiệm lấy từ cỏc cõy in vitro khỏe. Cỏc mẫu ủược cấy trờn mụi trường là MS + 1mg/l Kinetin + 10% nước dừa.
Mẫu thớ nghiệm là cỏc ủỉnh ủoạn thõn mang mắt ngủ ủược cắt thành từng ủoạn nhỏ dài 0,5 - 1cm ủược cấy trờn mụi trường là MS + 1mg/l Kinetin + 10% nước dừa, trong cỏc ủĩa peptri với số lượng 60mẫu/ủĩa. Sau ủú ủược ủem ủi chiếu xạ tia gamma (nguồn Co60).
Thớ nghiệm 2: Nghiờn cứu sự sinh trưởng phỏt triển và biến dị của cỏc chồi sau chiếu xạ cấy chuyển lần 2.
Lần cấy chuyển 2 Liều chiếu xạ Giống trắng Giống đỏ Đ/C (Không chiếu xạ) CT1 CT1 1Krad CT2 CT2 2Krad CT3 CT3 3Krad CT4 CT4 4Krad CT5 CT5 5Krad CT6 CT6
Cỏc chồi sau chiếu xạ ở thớ nghiệm 1 ủược tiếp tục nuụi cấy trờn mụi mụi trường là MS + 1mg/l Kinetin + 10% nước dừa. Chu kỳ cấy chuyển 4 tuần/lần.
Thớ nghiệm 3: Nghiờn cứu khả năng tạo cõy hoàn chỉnh của cỏc chồi biến dị sau chiếu xạ. Giống Liều chiếu xạ Cẩm chướng trắng Cẩm chướng ủỏ ð/C (Khụng chiếu xạ) CT1 CT1 1Krad CT2 CT2 2Krad CT3 CT3 3Krad CT4 CT4 4Krad CT5 CT5 5Krad CT6 CT6
Mẫu cấy là cỏc chồi sau lần cấy chuyển ở thớ nghiệm 2. Cỏc mẫu ủược cấy trờn mụi trường ra rễ là MS + 0,5mg/l αNAA + 0,5 gam than hoạt tớnh.
* Cỏc thớ nghiệm ủược bố trớ hoàn toàn ngẫu nhiờn, mỗi cụng thức ủược cấy 60 mẫu chia làm 3 lần nhắc lại.
Cỏc chỉ tiờu theo dừi ủược quan sỏt và ủo ủếm ủịnh kỳ một tuần một lần.
Thớ nghiệm 4: Nghiờn cứu sự sinh trưởng, phỏt triển trong ủiều kiện tự nhiờn của cõy cẩm chướng in vitro sau chiếu xạ.
Cỏc cõy in vitro thu ủược ở thớ nghiệm 3 ủược ủưa ra vườn ươm ủể thớch nghi với ủiều kiện tự nhiờn bằng kỹ thuật thuỷ canh. Sau 4 tuần ủưa ra trồng ở ruộng sản xuất.
CT1: ð/C (Khụng chiếu xạ) CT2: 1Krad
CT4: 3Krad CT5: 4Krad CT6: 5Krad
Thớ nghiệm bố trớ tuần tự khụng nhắc lại. Cỏc chỉ tiờu theo dừi: 2 tuần/lần.
Tại vườn ươm theo kỹ thuật thuỷ canh của Trung tõm nghiờn cứu phỏt triển rau Chõu Á (AVRDC).
Tại vườn trồng theo quy trỡnh của Viện Rau quả - Hà Nội
3.3.2. Phương phỏp nghiờn cứu
3.3.2.1. Phương phỏp nuụi cấy mụ tế bào thực vật.
Cỏc thớ nghiệm in vitro ủược tiến hành theo phương phỏp nuụi cấy mụ hiện hành.
Sử dụng phương phỏp nuụi cấy in vitro trờn mụi trường cơ bản MS (Murahige & Skoog, 1962 với 6,2 g/l agar, 30 g/l saccarose và 100 mg/l innositol). Mụi trường nhõn nhanh là: MS + 1mg/l Kinetin + 10% nước dừa. Mụi trường ra rễ tạo cõy là: MS + 0,5mg/l αNAA + 0,5 gam than hoạt tớnh.
Cỏc thớ nghiệm nhõn nhanh, tạo cõy mẫu ủược nuụi cấy trong trụ miệng hẹp 250ml. Tất cả cỏc mụi trường muụi cấy ủược ủiều chỉnh ủộ pH bằng 6,0 trước khi tiệt trựng và ủược khử trựng ở 1200C trong 20 phỳt.
- ðiều kiện thớ nghiệm: cỏc thớ nghiệm tiến hành trong ủiều kiện nhõn tạo, ủiều kiện ỏnh sỏng, nhiệt ủộ, ủộẩm luụn ủược giữổn ủịnh:
+ Cường ủộ ỏnh sỏng: 2000 Lux
+ Thời gian chiếu sỏng: 16h sỏng/8h tối + ðộẩm: 70 - 80%
3.3.2.2. Phương phỏp chiếu xạ tia gamma
- Vật liệu là chồi in vitro cõy cẩm chướng ủược cắt bỏ lỏ, ủoạn thõn ủược cắt thành cỏc mẫu cú kớch thước khoảng 0,5 - 1cm, lựa chọn mẫu ủồng ủều nhau cỏc ủoạn thõn mang mắt ngủ cẩm chướng in vitro. Mẫu ủược cấy trờn mụi trường là MS + 1mg/l Kinetin + 10% nước dừa trong ủĩa petri với số lượng 60 mẫu/ủĩa.
- Mẫu ủược chiếu xạ tia gamma (nguồn Co60) ở cỏc liều 0, 1, 2, 3, 4, 5, Krad trong thời gian 1h.
- Quỏ trỡnh chiếu xạ tiến hành tại Bệnh Viện K - Hà Nội.
- Cỏc mẫu sau chiếu xạ ủược cấy trờn mụi trường nhõn nhanh tốt nhất ủó tỡm ủược MS + 1mg/l Kinetin + 10% nước dừa ủể duy trỡ khả năng sống, tỏi sinh và ủỏnh giỏ ảnh hưởng của cỏc liều chiếu xạ.
3.3.2.3. Kỹ thuật trồng trọt
Cỏc thớ nghiệm ủưa cõy in vitro ra ngoài vườn ươm ủược tiến hành như sau: Khi cõy ủạt tiờu chuẩn (cõy cao trờn 3,5 cm, cú từ 4 - 5 rễ trở lờn, rễ dài khoảng 2,5 - 3,0 cm) thỡ rỳt nhẹ nhàng ra khỏi bỡnh, rửa sạch mụi trường bỏn ở rễ và ủem trồng trong bồn thuỷ canh với dung dịch dinh dưỡng Anthura.
- Tại vườm ươm: Theo phương phỏp thuỷ canh tĩnh của Trung tõm nghiờn cứu phỏt triển rau Chõu ỏ (AVRDC).
Thuỷ canh là một trong những phương phỏp canh tỏc tiờn tiến nhất trong nền sản xuất hiện ủại, cõy ủược trồng trong nước và dung dich dinh dưỡng. Với phương phỏp này, cõy trồng cú thể tăng trưởng và phỏt triển mạnh do ủược cung cấp khoỏng chất trực tiếp thụng qua hệ thống rễ luụn tiếp xỳc với mụi trường.Một hộp xốp cú kớch thước thay ủổi tuỳ theo từng loại cõy trồng. Thường cú chiều dài 50 - 60 cm, rộng 40 cm và cao 30 cm. Hộp xốp cú tỏc dụng giữ cho dung dịch nuụi cấy khụng bị thay ủổi về nhiệt ủộ gõy sốc cho cõy.
- Tại vườn trồng:
Chọn ủất trồng cẩm chướng phải cao rỏo, ủất tốt, nhiều mựn luống cao trỏnh nắng, luống rộng 1,2 - 1,5m, cao 20 - 25cm.
ðất phải làm kỹ, nhỏ mịn, lờn luống phẳng, thụng thường luống rộng 80cm, mặt luống 60cm.
Phõn bún: 10kg phõn chuồng mục, 1kg Tecmo phốt phỏt, 1kg vụi bột, 0,5kg kali sunphỏt, trộn ủều rải trờn ủất, xới nhẹủể trộn.
Cõy non ở tại vườn ươm khoảng 25 - 27 ngày rồi mới trồng ra ruộng mật ủộ 25 x 30cm.
Mật ủộ khoảng cỏch bằng trồng với khoảng 30 x 30cm Sau khi trồng ta tưới nước, tưới thường xuyờn 1 ngày/lần cho tới khi cõy ra nụ.
3.3.3. Cỏc chỉ tiờu theo dừi
3.3.3.1. Cỏc chỉ tiờu theo dừi trong phũng:
- Tỷ lệ mẫu sống (%) = (Số mẫu sống/Tổng số mẫu thớ nghiệm) x 100. - Tỷ lệ mẫu bật chồi (%) = (Số mẫu bật chồi/Số mẫu sống) x 100. - Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) = (Số mẫu tạo rễ/Số mẫu sống) x 100.
- Tỷ lệ chồi biến dị (%) = (Số chồi biến dị/Số chồi thu ủược) x 100. - Số chồi /mẫu = Tổng số chồi thu ủược/ Tổng số mẫu bật chồi. - Chiều cao trung bỡnh chồi (cm) = Tổng chiều cao chồi/ tổng số chồi - Số lỏ trung bỡnh (lỏ) = Tổng số lỏ/Tổng số chồi tạo thành.
- Hệ số nhõn (chồi/mẫu) = Tổng số chồi tạo thành/Tổng số mẫu bật chồi.
- Số rễ TB của chồi = Tổng số rễ / Tổng số chồi ra rễ.
- Chiều dài TB rễ (cm) = Tổng chiều dài rễ dài nhất /Tổng số mẫu ra rễ.