phân tứ ĐNA allele hay phân tứ DNA mạch đơn cĩ hình dạng khác nhau dưới
điều kiện khơng biến tính (31). Sự phát hiện theo kiểu đặc hiệu trình tự dựa trên 4 cơ chế chung: sự lai đặc hiệu allele, sự kết hợp nucleotide đặc hiệu allele. sự
thất oligonucleotide đặc hiệu allele và sự phân tách lấn chiếm đặc hiệu ailele. Với cách tiếp cận lai, hai mẫu dị đặc hiệu allele được thiết kế để lai với trình tự đích chỉ khi chúng bắt cặp hồn tồn (hình 4). Dưới điều kiện được tối ưu, sự bắt cặp khơng hồn tồn ở một base sẽ khơng ổn định khi lại, ngăn mẫu
đị allele khỏi lai với trình tự đích. Vì khơng cĩ enzyme trong sự phân biệt aHele,
lai là cơ chế đơn giản nhất cho phân tích. Thách thức của phương pháp là đấm bảo phân biệt allele chính xác nằm ở chỗ thiết Kế mẫu dị. Với phương pháp
thiết kế mẫu đị tinh ví hơn và tác nhân hỗ trợ quá trình lai, như nhân tế gắn với
rãnh nhỏ DNA (MGB), mẫu dị đặc hiệu allele cĩ thế được thiết kế với tỷ lệ thành cơng cao. œ® > ị Hổ sung hồn lồn | Hổ sung khơng hồn tồn .. —.~.... C G ^ - + ° vai tr hổi s2 Vi ga
Sự hại xảy rũ Sự lại khơng xãy ra
Hình 4: Sự lai đặc hiệu allele (31)
Lai đặc hiệu allele cũng là nền tắng của mội số phương pháp phân tích SNP đặc hiệu. Những phương pháp này khác nhau ở cách chúng thơng báo sự kiện lai. Trong kỹ thuật 5'nuclease, mẫu đị lai với DNA đích đã được khuếch đại, bị tách ra trong suốt phần ứng PCR. Vì thế theo dõi sự kiện tách là một cách
“
18
I.2.5.2 Phân tích SNP dựa trên sự mở rộng mỗi
Mở rộng mỗi là một phương pháp phân biệt allele mạnh. Nĩ cĩ tính linh
động cao và địi hỏi lượng mổi/mẫu đị tối thiểu, Thiết kế mẫu đị và tối ưu hĩa kĩ thuật thường dễ thực hiện. Cĩ nhiều biến đổi trong cách tiếp cận mở rộng
mỗi, dựa trên khả năng DNA polymerase kết hợp deoxyribonucleotide đặc biệt
bổ sung với trình tự ĐNẦ mạch khuơn. Tuy nhiên, chúng cĩ thể được nhĩm lại
thành hai loại. Đầu tiên là cách tiếp cận trình tự (kết hợp những nucleotide đặc
hiệu allele) tại nơi base đa hình được nhận biết trên ĐNA đích. Thứ hai là cách tiếp cận PCR đặc hiệu allele nơi mà DNA polymerase được dùng để khuếch đại DNA đích chỉ khi mơi PCR hồn tồn bổ sung với trình tự DNA đích. (31)
Trong cách tiếp cận trình tự, người ta cĩ thể xác định trực tiếp trình tự DNA đích được khuếch đại bằng phép đo phố khối lượng hay thực hiện phần ứng
mở rộng mơi với DNA đích đã được khuếch đại như là mạch khuơn và phân tích
“
sản phẩm để xác định dạng base được gắn vào SNP (hình 5).
© c | Hổ sung hồn tuần | Bổ sung khơng hồn tồn $ G Ấ
Niồi được mở rộng Mỗi khơng được mở rộng Hình 5: Sự kết hợp nucleoude đặc hiệu aHele (31)
Trong cách tiếp cận PCR đặc hiệu aHele, người ta dựa trên DĐNA
polymerase để kéo dài một mơi chỉ khi đầu 3` cúa nĩ hồn tồn bố sung với mạch khuơn (hình 6). Khi điểu kiện này xảy ra, một sản phẩm PCR được to thành. Bằng cách xác định sắn phẩm PCR cĩ được tạo ra hay khơng, người ta cĩ
thể suy ra allele trên DNA đích. Đây chính là nguyên tắc của phương pháp ARMS-PCR được dùng trong nghiên cứu này, Vài cách tiếp cận cĩ tính chất đổi mới đã được dùng để xác định sự hình thành những sản phẩm PCR đặc hiệu như phương pháp dựa trên phân tích đường cong nĩng chấy hoặc phương pháp dựa
trên sự lại của mẫu dị đặc hiệu với mạch khuơn. (31)
ẹ € Š A | Bổ sung hồn tồn | Bổ sung khơng hồn tồn cx Tà =m— ——_—_Ừ ễ A
Mỗi được mở rộng Mơi khơng được mở rộng
Hình 6: Mở rộng mỗi đặc hiệu allele (31)
1.2.6 Khái quát về phương pháp dùng trong nghiên cứu
1.2.6.1 Phương pháp ARMS-PCR (Amplification refractory system PCR) ARMS-PCR là phần ứng PCR đặc hiệu allele. Loại phần ứng này đã được sử dụng khá nhiều trong phân tích SNP. Nĩ là kĩ thuật tương đối đơn giản và khi kết hợp với phân tích trên gel, kết quả cĩ thể được đọc cách dễ dàng. Vì sản phẩm cĩ cùng kích thước nên hai phần ứng song song phải được thực hiện để nhận điện allele khi điện di trên gel để phát hiện. Vì khơng cĩ cách để kiểm
sốt kết quả âm tính giả, những phần ứng PCR đặc hiệu aliele khơng được dùng
cho những dự án lớn. Mặt khác, PCR đặc hiệu allele khơng thể được thiết kế cho mọi SNP vì ánh hưởng của trình tự DNA đích và vì khả năng gặp khĩ khăn khi thực hiện những phần ứng cĩ nhiều cặp mỗi. (56)
20
I.2.6.2 Phương pháp Real-Time PCR đặc hiệu allele
Real-Time là một thuật ngữ chung để chí những kĩ thuật giúp chúng ta cĩ thể theo dõi được các giải đoạn của PCR thơng qua những chất phát huỳnh quang hay những chất cĩ đặc tính tương tự mà cĩ thể được nhận biết qua một
đầu đọc. Kĩ thuật Real-Time PCR trong phân tích SNP căn bản dựa trên nên
tảng quá trình lại đặc hiệu allele của những mẫu đị đánh đấu. Kĩ thuật được
trình bày sau đây là kĩ thuật Š5°nuclease, kĩ thuật dựa trên hoạt tính 5'nuclease của Taq DNA polymerase. (51)
Hoạt tính 5 nuclease của Tag DNA polymerase sẽ loại trừ những oligonucleotide lai với DNA đích trong quá trình nhân bản. Dựa vào quan sất này, kĩ thuật TagMan được phát triển với một mẫu dị được đánh dấu kép chứa một phức hợp thuốc nhuộm phát huỳnh quang C(MGB - Minor Groove Binđer) và thuốc dập. Trong suốt pha kéo dài của PCR, mẫu dị TagMan chỉ lai với DNA đích bổ sung hồn tồn. Sự thủy giải những mẫu đị đã liên kết với mạch DNA đích làm giải phĩng thuốc dập khối thuốc nhuộm phát huỳnh quang thơng báo và vì thế tín hiệu huỳnh quang được quan sát, Từ đĩ người ta cĩ thể biết được kiểu gen của mẫu bằng cách theo dõi tín hiệu huỳnh quang của hỗn hợp phản
ứng. Với số lượng lớn những cải tiến trong thiết kế kĩ thuật, như sự kết hợp với
MGB làm tăng khả năng phân biệt giữa các mẫu đị TagMan và với những hàm tính tốn mẫu đị đáng tin cậy hơn, kĩ thuật sẽ được tối ưu dễ dàng hơn. Chi phí của mẫu đị đánh đấu là một trở ngại chính cho việc phổ biến kĩ thuật này. Trong nghiên cứu này chúng tơi khơng dùng mẫu đị Tagman MGB mà chúng tơi dùng mẫu đị LNA huỳnh quang đánh dấu kép với cơ chế cũng tương tự. (47)
Trong suốt quá trình PCR của kĩ thuật 5 'nuclease diễn ra, những sự kiện sau đây xảy ra (hình 7):
21
Mỗi mẫu dị LNA gắn đặc hiệu với trình tự bổ sung tương ứng giữa vị trí của hai mồi suơi và ngược. Khi mẫu dị khơng bị tác động bởi DNA polymerase, thuốc dập gần thuốc nhuộm thơng báo sẽ chặn tín hiệu huỳnh quang. DNA
polymerase chỉ thuỷ phân những mẫu dị lai hồn tồn với mạch khuơn. Sự giải phĩng của thuốc nhuộm thơng báo khỏi thuốc dập làm tăng tín hiệu huỳnh quang.
Mẫu dị huỳnh quang đánh dấu kép
Mẫu dị huỳnh quang kép LNA. (48)
Mẫu dị huỳnh quang kép LNA là mẫu dị huỳnh quang được đánh dấu
kép, độ đặc hiệu và độ nhạy cao, được thiết kế cho Real-Time PCR. Chúng cĩ thể được dùng với hầu hết những thiết bị Real-Time PCR và hệ thống đa phân
tích khác vì đơn giản trong thiết kế và phạm vi ứng dụng nhiều loại phân tử đánh dấu khác nhau. Mẫu dị huỳnh quang kép LNA cĩ thể được dùng để định lượng, phân tích đường cong nĩng chảy cũng như trong nhiều kỹ thuật phân tích ở những cấp độ khác nhau.
Các loại phân tử đánh dấu cho mẫu dị huỳnh quang kép LNA cĩ thể cĩ
Cy5; ở đầu 3` cĩ thể dùng các phân tử thuốc đập như TAMRA, DABCYL, BHQ- 1, BHQ-2.
Những thuận lợi của mẫu dị huỳnh quang LNA: sự lại đặc hiệu và sự ổn
nhiệt được tăng lên; định lượng gen và phân biệt allele chính xác hơn; thiết kế
mẫu dị linh động và để đàng hơn đối với những trình tự đích phức tạp; tương thích với mọi thiết bị Real-Time PCR và thiết bị phần tích huỳnh quang khác.
Sự kết hợp LNA vào mẫu dị trong phản ứng Real-Time PCR giúp tăng tính ốn nhiệt của mạch kép và độ đặc hiệu khi mẫu đị lai với mạch khuơn, Cấu
trúc hĩa học của đơn phân LNA tăng độ ổn định của quá trình li giữa mẫu đị
với mạch đích. Kết quả là nhiệt độ nĩng chảy của chuỗi xoắn kép cĩ thể tăng lên đến §”C tính trên sự thay thế 1 đơn phân LNA, khi so sánh với mẫu đị huỳnh
quang DNA. Điều này tăng phạm vi ứng dụng trong nhiều điều kiện kĩ thuật và cho phép thao tác cùng một lúc thành cơng trên số lượng mẫu lớn. Hơn nữa, cĩ thể tối ưu Tạ và sự lai đặc hiệu thơng qua những vị trí riêng biệt của base LNA trên mẫu đồ trong quá trình thiết kế chúng, (48)
Bảng 4: Tăng số base LNA trong mẫu đồ làm tăng Tụ (48)
Trình tự mẫu đị (5'-3') BaseLNA | TƠ, | AT, | AT„/LNA
dGdTdGdAdTdAdTdGdC - 29G | - -
dG+TdGdA+TdA+TdGdC 3 44°C | 15% +5%C +G+T+G+A+T+A+T+G+C 9 64) |35%]} +39
”T„ của chuỗi xoắn kép giữa mỗi và trình tự DNA bổ sung với nĩ. Ký hiệu + cĩ nghĩa là base LNA
Khả năng của mẫu dị dễ dàng phân biệt SNP, dạng phổ biến nhất của sự đa dạng di truyền, được tăng lên mạnh mẽ bởi kết hợp với base LNA. Dùng LNA để phân biệt aHele là phương tiện hiệu quả và độ tin cậy rất cao trong ứng
dụng phân tích SNP. Sự hiện điện của một một điểm bắt cặp khơng hồn tồn
khi hình thành xoắn kép giữa một mẫu dị huỳnh quang LNA và DNA đích sẽ biểu hiện mất ổn định hơn so với mẫu dị huỳnh quang DNA truyền thống. Mẫu
dị kết hợp với LNA sẽ ngắn hơn khi được dùng tại cùng một nhiệt độ như mẫu dị truyền thống. (48)
Vì đặc tính lai và T„ được tăng lên của LNA, mẫu đị chứa LNA cĩ thể
được tổng hợp ngấn hơn, cho phép sự linh động trong thiết kế trong khi vẫn thỏa mãn được những yêu cầu kĩ thuật của phương pháp. Như thế, những giới hạn chủ
yếu trong thiết kế, khơng thể vượt qua bởi mẫu dị DNA truyền thống, bây giờ được giảm xuống và cĩ thể bị loại trừ. Hơn nữa, bởi sử dụng mẫu dị huỳnh quang NA, mẫu dị ngắn hơn cĩ thể được thiết kế nhắm vào những trình tự đích
phức tạp như vùng giàu AT hay GC. Tương tự, thiết kế mẫu đị đối với những
SNP khĩ nghiên cứu như những điểm bắt cặp khơng hồn tồn G:T tương đối ổn định thì cực kỳ dễ đàng với LNA. Ví dụ, mẫu đị giàu AT thường cần trên 30 base (thỉnh thoảng trên 40 base) để thỏa mãn những yêu câu thiết kế — nhưng
thính thống vẫn cĩ biểu hiện kém. Với mẫu đồ huỳnh quang NA, việc chọn lựa những vị trí thay thế bằng base LNA làm đễ dàng cho việc tối ưu thiết kế, những mẫu dị sẽ ngắn và đặc hiệu hơn, cĩ biểu hiện rất tốt, thậm chí với chiều
đài từ 13 đến 20 base. (48)
Mẫu dị LNA tương thích với những thiết bị Real-Time PCR và thiết bị phân tích huỳnh quang cuối, phụ thuộc vào độ dài sĩng hấp thu hay phát xạ của thuốc nhuộm và thiết bị. Điều này cho phép chúng ta thoải mái làm việc với những thiết bị và chất phần ứng đã chọn dùng trong những điều kiện phổ biến
nhất. Khơng thêm một phí tổn nào. Các oligonucleotide chứa LNA tuân theo
cùng một chương trình tổng hợp và cải biên như những base DNA và RNA. Chúng hịa tan được trong nước và những dung dịch đệm chuẩn, và tuân theo qui luật bắt cặp căn bản của Watson-Crick. (48)
Đĩ là những thuận lợi của mẫu đị NA so với những loại mẫu đị đánh
24
mẫu dị LNA đáp ứng mọi yêu cầu và làm cho nĩ trở thành một ứng cử viên sáng giá nhất, ưu tiên được lựa chọn để sử dụng. Cĩ thể nĩi mẫu dị LNA là thế
hệ mẫu dị tiên tiến nhất hiện nay. (48)
L3 Gen Lymphotoxin-alpha 13.1 Lymphotoxin-alpha
Lymphotoxin-alpha (LTA) là một cytokine, protein tiết cĩ cấu tạo từ ba
tiểu phần giống nhau (homotrimeric), được tiết bởi tế bào bạch huyết hoạt hĩa và đĩng vai trị điều điểu hịa đáp ứng miễn dịch. LTA cĩ chung thụ quan với nhân tố kháng khối u (TNF). LTA là một glycoprotein với trọng lượng phân tử
tương đối là 60.000-70.000 Da, những tiểu phần của LTA cĩ trọng lượng phân tử là 25.000Da. TNF-B (cịn được gọi là lymphotoxin-ơ, LTA) cĩ 35% giống hệt và
50% tương đồng với trình tự amino acid của TNF-œ. LTA làm trung gian cho nhiều đáp ứng kháng virus, kích thích miễn dịch và đáp ứng viêm. LTA cũng
liên quan đến sự hình thành cơ quan bạch huyết thứ cấp và đĩng vai trị trong sự chết theo chương trình của tế bào (hình §).
Các dạng TNF-alipha và TNE-beta (LT) Tế bào đích “# w xur!ace TNE-fd 7 “,# TNFR1 «.. Ị TNF- “... l Me Đại thực bào Tế bào T
Hình 8: Sự gắn với thụ quan và các dạng của TNF-œ và TNF-B (LTA). TNE-œ được biểu hiện trên bể mặt tế bào, sau đĩ bị thủy giải thành dạng hịa tan gồm 3 tiểu
phần giống nhau. TNF-B (LTA) khơng cĩ thành phần gắn màng nhưng cĩ thể hình thành dạng
- ch
1.3.2 Vị trí của gen UTA
Gen LTA cĩ kích thước 2005 base, hướng +. Bản đồ của TNF-B nằm giữa
vùng C4 và HLA-B. Cụm gen TNF-ơ và TNF-B khoảng 210 kb tính từ vùng
HLA-B trên 6p21.3.
SNP LTA+§0 (ký hiệu rs2239704 theo NCB]) nằm trên nhiễm sắc thể sế
6, vị trí 31648120 (-). Allele tại vị trí SNP là G/T. SNP này nằm ở vùng promoter của gen LTA là vùng khơng được dịch mã.
L3.3 Di truyền phân tử Hiên quan đến gen LTA
Koss và cộng sự (2000) nhận thấy phụ nữ thay vì đần ơng viêm ruột kết ngoại biên mang SNP -308G/A ở promoter của gen TNE. Mối liên hệ thậm chí mạnh hơn ở những phụ nữ cĩ kiểu gen A thay vì C tại vị trí 720 của gen LTA. Những SNP này cũng liên quan đến sự sản xuất TNE cao hơn nhiều trong những bệnh nhân Crohn, trong khi sự thay thế A cho G tại vị trí -238 trên gen TNE liên quan đến sẵn xuất TNF ít hơn ở những bệnh nhân bị viêm ruột kết gây loét.
Knight và cộng sự (2003) mơ hình hĩa ím vivo những SNP cĩ vai trị điều hịa. Họ đã nhận biết được sự gắn khác nhau giữa protein-DNA trong ín vivo liên quan đến những thay đổi allele trên gen. Ứng dụng hướng tiếp cận này với LTA
để xác định những allele đặc biệt cĩ chức năng quan trọng liên quan tới sự phiên
mã LLTA.
Bằng nghiên cứu ca/chứng trên tỉ lệ lớn, sử dụng 92.788 SNP, Ozaki và
cộng sự (2002) đã xác định được những vị trí tiểm năng trên 6p21 nhạy cảm với chứng nhồi máu cơ tim. Cĩ một mối liên hệ đáng chú ý giữa chứng nhồi máu cơ tìm và một kiểu hình đơn 50 kb bao gồm 5 SNP trên LTA, NFKBILI và BATI. Sự đồng hợp tứ đối với mỗi SNP trên LTA liên quan chặt chế với nguy cơ tăng của chứng nhồi máu cơ tìm. Phân tích chức năng iw viro xác định một SNP trên
26
vùng mã hĩa của gen LTA, thr26 thành asn, đã làm tăng cảm Ứng vài phân tử gắn chặt với tế bào lên hai lần, bao gầm VCAMI, trong những tế bào cơ trơn cĩ mạch ở động mạch vành ở người. Hơn nữa, một SNP trong vùng intron 1 của