3. đỐI TƯỢNG, đỊA đIỂM, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ
3.3.2.Phương pháp nghiên cứu
+ Xác ựịnh tỷ lệ lợn nái mắc bệnh viêm tử cung bằng phương pháp ựiều tra, phỏng vấn trực tiếp công nhân tại trại, kết hợp với theo dõi trực tiếp.
3.3.2.1. Lấy mẫu dịch tử cung của lợn bình thường sau ựẻ và lợn ựang bị viêm tử cung.
* Cách lấy mẫu dịch tử cung lợn xét nghiệm:
Ớ Lấy mẫu dịch tử cung của lợn nái bình thường sau ựẻ 12-24h và lợn
bị viêm tử cung. Phân lập, giám ựịnh thành phần và số lượng vi khuẩn trên các môi trường chuyên dụng theo các phương pháp vi sinh vật thường quỵ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 37
Ớ Làm kháng sinh ựồ theo phương pháp của Kirby-Bauer (1996).
Ớ Giấy tẩm kháng sinh do hãng Oxoid (Anh) sản xuất.
Ớ đánh giá kết quả dựa theo tiêu chuẩn quốc tế 1996.
- Với lợn sau ựẻ: dùng mỏ vịt (ựã ựược sát trùng) mở âm ựạo, sau ựó lấy thìa sản khoa thu dịch tử cung cho vào ống nghiệm ựã ựược vô trùng, mỗi lần lấy khoảng 3-5ml.
-Với lợn bị viêm, dùng mỏ vịt (ựã ựược sát trùng) mở âm ựạo, sau ựó lấy thìa sản khoa thu dịch tử cung cho vào ống nghiệm ựã ựược vô trùng, mỗi lần lấy khoảng 3-5ml.
* Bảo quản và xử lý mẫụ
- Các mẫu thắ nghiệm sau khi lấy ựược giữ trong tủ lạnh ở nhiệt ựộ 2-
80C trong vòng 24h ựưa ựến phòng thắ nghiệm và tiến hành kiểm tra theo
phương pháp nghiên cứu vi khuẩn học của tác giả (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) [14]; (Phạm Kim Anh, Nguyễn Văn Quỳnh, 1991) [1]; (Nguyễn Văn Quỳnh, 1991) [15].
- để có thể ựếm ựược số khuẩn lạc trên môi trường thạch thường, tùy theo số vi khuẩn có trong bệnh phẩm. Mẫu xét nghiệm cần phải pha loãng ựến mức ựộ cần thiết. Sau nhiều lần cấy mẫu với các ựộ pha loãng khác nhau, chúng tôi xác ựịnh ựược ựộ pha loãng thắch hợp với các bệnh phẩm như saụ
+ Dịch tử cung lợn sau ựẻ là: 10-4.
+ Dịch tử cung lợn viêm tử cung là: 10-7.
- đếm tổng số khuẩn lạc trên một ựĩa thạch và quy ựổi trong 1ml dịch tử cung.
- Sau khi pha loãng, chúng tôi tiến hành cấy vi khuẩn vào thạch ựĩạ Mỗi mẫu xét nghiệm ựược ựưa vào 2 ựĩa thạch thường và ựĩa thạch phân lập,
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 38
mỗi ựĩa thạch ựược cấy 0,1ml dịch và ựánh số. Tất cả ựược bồi dưỡng trong tủ
ấm 370C /24h. Sau ựó ựếm số khuẩn lạc có trong các ựĩa ở môi trường thạch
thường và thạch chuyên dụng. Số vi khuẩn trong 1ml dịch mẫu ựược tắnh theo công thức.
X=10.ẠN
Trong ựó X : số khuẩn lạc trong 1ml dung dịch. A : số khuẩn lạc trung bình trên 1 ựĩạ N : ựộ pha loãng.
để ựếm ựược tống số các loại vi khuẩn có trong dịch nghiên cứu, trước tiên chúng tôi dùng môi trường thạch thường ựể ựếm tổng số các loại vi khuẩn có trong một ựĩa thạch ở ựộ pha loãng thắch hợp. đồng thời chúng tôi còn sử dụng các môi trường chuyên dụng sau ựể ựếm các loại vi khuẩn có mặt chủ yếu ở tử cung lợn khi bị viêm:
+ Môi trường Sapman dùng ựể ựếm vi khuẩn Staphylococcus.
+ Môi trường Edwards medium dùng ựể ựếm vi khuẩn Streptococcus.
+ Môi trường Brilliant green agra dùng ựể ựếm vi khuẩn Ẹcoli và
Salmonellạ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tổng số khuẩn lạc có trong 2 ựĩa thạch trên phải nhỏ hơn hay bằng
tổng số khuẩn lạc có trên ựĩa thạch thường ở cùng một nồng ựộ pha loãng.
3.3.2.2. Phương pháp xác ựịnh số loại và số lượng vi khuẩn.
- Các ựĩa thạch thường sau khi ựã ria cấy vi khuẩn, bồi dưỡng trong tủ
ấm 37oC/24h, lấy ra quan sát hình thái, kắch thước và dạng khuẩn lạc. Từ ựó sơ
bộ ựịnh loại vi khuẩn.
- Mỗi loại vi khuẩn, khi mọc trên môi trường có thể sẽ hình thành một loại khuẩn lạc có kắch thước, hình dáng và màu sắc riêng biệt như:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 39
+ Staphylococcus: khuẩn lạc dạng S, rìa gọn, tròn, mặt lồi, láng bóng
và có màu vàng rơm (nếu là Staphylococcus aureus).
+ Streptococcus: khuẩn lạc dạng S, nhỏ, màu hơi xám bóng.
+ Salmonella: khuẩn lạc dạng S, có thể khuẩn lạc dạng R, khuẩn lạc
tròn trong sáng hoặc xám, nhẵn bóng, hơi lồi lên ở giữạ
+ Ẹcoli: khuẩn lạc dạng S, có thể khuẩn lạc dạng R, khuẩn lạc tròn
ướt,không trong suốt, màu tro, trắng nhạt hai ựầụ
Sau khi xác ựịnh ựược các loại khuẩn lạc khác nhau, mỗi loại khuẩn lạc lại tiến hành phiết kắnh, nhuộm Gram ựể xem hình thái, tắnh chất bắt màu và cấu trúc ựặc biệt của vi khuẩn như;
+ Staphylococcus: bắt màu (Gram +), hình cầu, tụ lại hình chùm nhọ
+ Streptococcus: bắt màu (Gram +), có hình cầu hoặc hình trứng, ựứng
riêng lẻ hoặc chuỗị
+ Ẹcoli: bắt màu (Gram-), là trực khuẩn hình gậy ngắn 2 ựầu tròn.
+ Salmonella: bắt màu (Gram -), là trực khuẩn hình gậy ngắn, hai ựầu tròn.
Khuẩn lạc ựã ựược tách thuần khiết, cấy vào các môi trường phân lập ựể xác ựịnh tắnh chất mọc của chúng trong các môi trường nàỵ
+ Môi trường Sapman : Staphylococcus khuẩn lạc to, rìa gọn. Nếu là tụ
cầu gây bệnh thì môi trường biến thành màu vàng, tụ cầu không gây bệnh thì môi trường giữ nguyên màu ựỏ.
+ Môi trường Edwards medium: Streptococcus khuẩn lạc nhỏ, mặt hơi
lồi, ướt mịn, rìa gọn.
+ Môi trường Brilliant green agra: Ẹcoli làm môi trường biến màu
vang chanh. Salmonella làm môi trường có màu ựỏ.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 40
Toàn bộ quy trình thắ nghiệm xác ựịnh số lượng, số loại phân lập vi khuẩn có trong dịch tử cung lợn bình thường và bệnh lý rồi ựược kiểm tra tắnh mẫn cảm của vi khuẩn với kháng sinh và thuốc hóa học trị liệu từ ựó ựưa ra phác ựồ ựiều trị. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.3.2.3. Xác ựịnh ựộ mẫn cảm của các chủng vi khuẩn phân lập ựược từ dịch tử
cung lợn với các thuốc hóa học trị liệu bằng phương pháp làm kháng sinh ựồ.
- Tiến hành làm kháng sinh ựồ theo phương pháp khuếch tán trên
thạch của Kirby-Bauer.
- Phương pháp chỉ dùng canh trùng nuôi cấy vi khuẩn ở 370C trong 24
giờ, ria cấy trên mặt thạch. để ựĩa thạch từ 3-5 phút. Sau ựó dung panh vô trùng ựặt các mảnh giấy kháng sinh tiếp xúc với mặt thạch. Các mảnh giấy kháng sinh ựặt cách nhau không dưới 24mm.
- Sau khi ựặt các mảnh giấy vào ựĩa thạch ựược khoảng 15 phút, ựặt
ựĩa thạch vào tủ ấm 370C, sau 16-18 giờ lấy ra ựọc kết quả. Kết quả ựược ựọc
bằng cách dùng thước mm ựể ựo ựường kắnh của vòng vô khuẩn, ựo phắa sau mặt ựĩa thạch. Nếu cạnh của vòng ức chế không rõ nét thì phải ựo chỗ hẹp nhất và chỗ rộng nhất rồi lấy giá trị trung bình. đường kắnh của vòng vô khuẩn ựược tắnh ra mm. Nếu khuẩn lạc trong vòng ức chế rõ ràng thì phải nuôi cấy, phân lập và thử lạị
- Kết quả kháng sinh ựồ chỉ ựược ứng dụng ựiều trị với vi khuẩn mẫn
cảm với thuốc kháng sinh, còn khi vi khuẩn ựã kháng thuốc tức vòng vô khuẩn dưới mức diệt khuẩn thì không ựược dùng.
- Khi vi khuẩn ở mức rất mẫn cảm chúng ta sử dụng thuốc ở liều ựiều
trị trung bình khi vi khuẩn mẫn cảm ở mức trung bình thì ựiều trị ựã chọn phải dùng ở liều cao hơn, hoặc bơm thẳng vào vị trắ ựang bị bệnh trong cơ thể (bơm vào tử cung).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 41
3.3.2.4. Phương pháp xác ựịnh các ựại lượng
+ Tỷ lệ lợn mắc bệnh (%) =
+ Tỷ lệ ựộng dục lại (%) =
+ Tỷ lệ thụ thai (%) =
3.3.2.5 Phương pháp xác ựịnh các chỉ tiêu lâm sàng.
để xác ựịnh một số chỉ tiêu lâm sàng chắnh như: thân nhiệt, màu sắc, dịch viêm, mức ựộ thu nhận thức ăn chúng tôi ựã sử dụng những phương pháp thường quy, ựếm nhiều lần hoặc quan sát vào một thời ựiểm quy ựịnh và lấy số bình quân.
+ Thân nhiệt: dùng nhiệt kế thủy ngân ựể ựo ở trực tràng lợn, một ngày ựo 2 lần:
- Sáng 7- 9h - Chiều 16 - 18h
+ Màu sắc dịch viêm: theo dõi quan sát bằng mắt thường và ghi chép + Bỏ ăn: kiểm tra lượng thu nhận thức ăn và ghi chép