- Phân tích RFLPs với sản phẩm PCR khi dùng cặp mồi đặc hiệu.
Dùng kỹ thuật PCR cho ribotyping:
Kỹ thuật PCR ribotyping là ứng dụng các cặp mồi đặc hiệu để nhân các vùng gene của ARN (thuộc ribosom hay ARN vận chuyển). Tuy nhiên, trong thực tế kỹ thuật này yêu cầu kinh nghiệm, kỹ thuật và tốn thời gian để thực hiện phép lai. Để khắc phục hạn chế này một cách tiếp cận được trình bày ở đây là phân tích đa hình (dấu vân tay) của
vùng gene này hay vùng gene xen kẽ của rARN hoặc tARN.
Hầu hết các chủng vi khuẩn đều chứa 2-22 phiên bản rARN trong mỗi tế bào (Gottlie và Rundner, 1985) trong khi đó vùng xen kẽ giữa 16S và 23S chứa một số các đoạn ADN lặp lại (Bacot và Reeves, 1991). Trong khi đoạn gene mã hoá cho tARN khá bảo thủ thì vùng xen kẽ của tARN lại thay đổi từ 2-35bp đối với Bacillus subtilis (Vod, 1985) và từ 2-208bp trên đối tượng E.coli (Jinks-Roberson và Nomura, 1987). Như vậy khi sử dụng cặp mồi nhân toàn bộ vùng gene tARN có thể tạo ra được sự khác biệt giữa các chủng vi sinh vật. Kết quả ứng dụng kỹ thuật này trên một số đối tượng được trình bày trong bảng 1.9.
Bảng 1.10.. Một số ví dụ sử dụng kỹ thuật PCR cho ribotyping.
Vi sinh vật Tác giả và tài liệu dẫn
Vi khuẩn lactic Klijin etal.(1991)
Listeria Czajka et al.(1993)
Mycoplasma Van Kuppeveld et al.(1992)
Pseudomonas cepacia Kostman et al.(1992)
Pseudomonas solanacearum Seal et al.(1992b)
Staphylococcus spp. Welsh &McClellADN(1992)
Streptococcus spp. McClellADN(1992)
Khi số phiên bản rARN tăng có nghĩa là làm tăng độ nhạy của phương pháp ứng dụng. Engstrand và cộng tác viên (1920) đã công bố có thể sử dụng mẫu dò là đoạn nucleotid bổ sung với đoạn 16S của rARN như là một trong số mồi cho phép nhân phiên mã ngược ARN và phép phân tích được thực hiện nhờ kỹ thuật PCR nhân sản phẩm cDNA được dùng cho phát hiện Helicobacter spp. Độ nhạy của phương pháp phát hiện này tăng 50 lần so với phương pháp truyền thống.
+ Kỹ thuật rep-PCR:
Một phương pháp trực tiếp cho kết quả finger printing không cần sử dụng enzym cắt hạn chế là rep-PCR dựa trên nguyên tắc nhân các đoạn gene lặp lại. Thuật ngữ rep- PCR là chỉ phương pháp chung sử dụng cặp mồi đặc hiệu để nhân các chuỗi lặp lại phổ biến trong các vi sinh vật thuộc cơ thể nhân sơ. Các chuỗi lặp lại có độ bảo thủ cao trong các đối tượng thuộc Enterobacteriaceae và một số đối tượng khác (Versalovic và Lupsky, 1991). Dùng các đoạn mẫu dò bảo thủ có thể lai với cả hai đoạn ADN lặp lại: đoạn có kích thước 126bp (Enterobacterial repetitive intergeneic concensus-ERIC) và đoạn 38bp (repetitive extrageneic palindromic-REP) từ bộ gene của Enterobacteriaceae
vi khuẩn gram âm và một số chủng có quan hệ xa khác. Có thể trực tiếp thiết kế cặp mồi cho các đoạn gene bảo thủ để thu được kết quả finger printing sau khi nhân gene dùng bộ gene của các vi sinh vật có mang các đoạn gene bảo thủ này. Sau khi điện di có thể phát hiện được trên agarose các đoạn gene có kích thước khác nhau từ các
nguồn vi sinh vật khác nhau. Kỹ thuật này được ứng dụng đã đem lại kết quả tốt khi nghiên cứu mối quan hệ trên các đối tượng Bacillus subtilis (Versalovic và cộng sự, 1992), Citrobacter diversus (Woods và cộng sự, 1991), Rhizobium meliloti (Brujin, 1992). Thực tế phương pháp tạo ra kết quả finger printing đa dạng từ hầu hết các đại diện của Enterobacteriaceae (Versalovic và cộng sự, 1991) và được ứng dụng trên tất các vi khuẩn có mang các đoạn gene bảo thủ lặp lại trên.
Phương pháp tương tự cũng cho phép phát hiện sự khác nhau từ các nguồn ADN trên các đối tượng nhân thực thuộc chi Naegleria như mô tả của Belkim và Quint (1992). Phương pháp này dùng cho phát hiện đa hình các đoạn gene chung cho cả vi sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn.