Định l−ợng bằng kỹ thuật đo phóng xạ miễn dịch (Immunoradiometric assay: IRMA) hay còn gọi là định l−ợng miễn dịch phóng xạ không cạnh tranh (Non- competitive assay) là ph−ơng pháp cải tiến của RIẠ Kỹ thuật này do Miles và Hales đề xuất từ năm 1965 nh−ng mUi đến những năm 1980 nhờ sản xuất đ−ợc kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody) ph−ơng pháp này mới thể hiện đ−ợc tính −u việt trong ứng dụng lâm sàng. Kỹ thuật IRMA có độ đặc hiệu rất cao (không có phản ứng chéo) nhờ sử dụng kháng thể đơn dòng đánh dấu phóng xạ.
4.1. Nguyên lý
Chất cần định l−ợng đóng vai trò kháng nguyên (KN) đ−ợc kết hợp với kháng thể t−ơng ứng đU đánh dấu phóng xạ (KT*). L−ợng kháng thể t−ơng ứng đ−a vào luôn ở mức d− thừa để kết hợp đ−ợc với tất cả kháng nguyên tham gia phản ứng. Kết quả là nếu l−ợng KN càng tăng thì phức hợp KN-KT*(phần B) đ−ợc tạo ra càng nhiềụ Nh− vậy hoạt độ phóng xạ của phần B tỷ lệ thuận với nồng độ chất cần định l−ợng.
Phổ biến nhất trong ph−ơng pháp IRMA là kĩ thuật kháng thể kép (kỹ thuật Sandwich). Trong kỹ thuật này, chất cần định l−ợng là kháng nguyên đ−ợc liên kết giữa hai kháng thể. Kháng thể thứ nhất có thể là đơn dòng hoặc đa dòng đ−ợc gắn vào pha rắn nh− thành ống nghiệm hoặc các hạt nhựạ Kháng thể thứ hai phải là kháng thể đơn dòng đU đ−ợc đánh dấu phóng xạ. Kháng nguyên cần định l−ợng sẽ liên kết giữa hai kháng thể này (hình 5.3).
Hình 5.3: Sơ đồ kỹ thuật Sandwich của ph−ơng pháp IRMA 1. Pha rắn (thành ống nhựa)
2. Kháng thể thứ nhất
3. Chất cần định l−ợng (kháng nguyên)
4. Kháng thể thứ hai đ] đ−ợc đánh dấu phóng xạ.
Đo hoạt tính phóng xạ phần liên kết kháng nguyên-kháng thể đánh dấu (phần B). Xây dựng đồ thị chuẩn dựa trên sự t−ơng quan giữa hoạt độ phóng xạ (phần B) và nồng độ của các mẫu chuẩn, từ đó tính đ−ợc nồng độ các chất cần định l−ợng.
4.2. Những điểm khác nhau cơ bản giữa ph−ơng pháp RIA và IRMA
Cả hai ph−ơng pháp RIA và IRMA đều là ph−ơng pháp định l−ợng miễn dịch phóng xạ nh−ng có những điểm khác nhau cơ bản sau:
- Trong kỹ thuật RIA: l−ợng KN* ở mức d− thừa còn KT ở mức giới hạn do đó có sự cạnh tranh giữa KN* và KN để liên kết với KT. Ng−ợc lại trong IRMA: l−ợng KT* đ−a vào ở mức d− thừa do vậy sau khi KN đU kết hợp hết với KT* thì vẫn còn một l−ợng nhất định KT* ở dạng tự dọ Chính vì vậy mà RIA là kỹ thuật cạnh tranh (Competitive assay) còn IRMA là kỹ thuật không cạnh tranh (Non-competitive assay). - Trong RIA kháng nguyên đ−ợc đánh dấu phóng xạ (KN*), trái lại trong IRMA kháng thể đ−ợc đánh dấu phóng xạ (KT*). Do đó hoạt độ phóng xạ của phần B trong
1 2 3 4
Hình 5.4: Đồ thị chuẩn của kỹ thuật IRMẠ
RIA tỷ lệ nghịch với nồng độ chất cần định l−ợng, còn trong IRMA thì ng−ợc lại (tỷ lệ thuận).
- Độ đặc hiệu của kỹ thuật IRMA hơn hẳn RIA vì kháng thể đ−ợc dùng trong IRMA là kháng thể đơn dòng.
- Độ nhạy của IRMA đạt ở mức 10-12 mol/l trong khi đó độ nhạy của RIA chỉ đạt cỡ 10 -10 mol/l.