Để thu được kết quả tối ưu cần có các yêu cầu kỹ thuật cụ thể cho từng bước thực hiện.
Đầu tiên là phải tạo ra được phổ dấu vân tay thu được sau khi xử lý mẫu với enzym cắt hạn chế. Phổ vân tay tối ưu khi các mảnh cắt phải được tách rõ và phân bố đồng đều về kích thước trên gel. Số lượng các mảnh ADN thu được phụ thuộc vào mẫu ADN và loại enzym cắt hạn chế được sử dụng. Thông thường phải chọn một số mẫu xử lý thử trước với từng loại enzym (hay đồng thời xử lý với một số enzym). Có thể thấy rõ là các enzym có 5 nucleotid tại vị trí cắt sẽ tạo ra sản phẩm nhiều mảnh hơn các enzym có 6 nucleotid tại vị trí nhận biết.
Thực tế cũng cho thấy khi dùng enzym cắt hạn chế (một hay đồng thời vài loại) để thu được phổ các đoạn cắt hợp lý cho việc phân tích ribotyping thì các kết quả này cũng rất khác nhau. Như vậy, điều quan trọng nên tiến hành trước các phép phân tích này, phải chọn được một số chủng đặc trưng và thử với một số enzym cắt hạn chế để chọn giải pháp cho nghiên cứu dịch tễ học với kỹ thuật này. Trong một số trường hợp kết quả phân tích khi chỉ tiến hành với 1 hay 2 enzym cắt hạn chế có thể không đưa ra được kết quả chính xác.
Như vậy, khi có được kết quả hợp lý sau khi xử lý các mẫu ADN với enzym cắt hạn chế thì tiến hành các bước chuyển các đoạn ADN trên gel lên màng theo các phương pháp đã được mô tả ở trên. Phương pháp chuyển bằng chân không là hợp lý hơn cả vì kết quả cho việc chuyển các băng có kích thước gần nhau lại được tách ra sắc nét trên màng. Khi thực hiện phép lai nên chú ý nếu như dùng nguồn ARN ribosom của một chủng nào đó đánh dấu làm mẫu dò thì cần phải thay đổi điều kiện lai như nhiệt độ để phép lai được thực hiện tốt với các đoạn ADN từ các chủng vi sinh vật khác nhau.
Có một số phương pháp đánh dấu mẫu dò là ADN ribosom. Phương pháp đánh dấu phóng xạ (Grimont, 1986), đây là phương pháp có ưu thế là chỉ cần vài bước đơn giản cho phép lai và rửa mẫu nhưng lại mang nhiều hạn chế như: thời gian bán huỷ ngắn, yêu cầu an toàn cho phòng thí nghiệm riêng biệt, nguy hiểm cho người dùng và gặp khó khăn với việc xử lý chất thải phóng xạ. Mới đây có một số phương pháp đánh dấu mẫu dò phi phóng xạ được sử dụng khá thành công. Pitcher (1987) đã mô tả phương pháp tổng hợp mẫu dò gắn với bilatin để phát hiện ARN ribosom của Providencia stuartii. Chất kích hoạt quang hoá đã được
Koblavi và Grimont mô tả (1990). ARN ribosom cũng được đánh dấu bằng acetylaminofluorence (AAF) do Grimont (1989) mô tả. Công ty Eurogeneetik (Bỉ) đã cung cấp phức hợp AAF-rARN trên thị trường.
Gần đây Gustafero và Persing (1992) đã đưa ra một phương pháp mới mà ở đây phức hợp horseradisk-peroxysase- polyethyleneimine với rARN và kích hoạt bằng quang hoá. Các mẫu dò được đánh dấu bằng các chất phi phóng xạ này có thể cho kết quả nhanh tương đương với trường hợp dùng các chất phóng xạ. Như vậy kết quả tiến hành phép lai các mẫu của các chủng khác nhau trong cùng gel chuyển lên có thể so sánh với nhau khi dùng kỹ thuật này. Trong trường hợp xác định chính xác kết quả các mảnh lai với mẫu dò có thể tiến hành so sánh các kết quả thu được từ các phòng thí nghiệm khác nhau.
+ Ứng dụng kỹ thuật ribotyping:
Xác định typ vi khuẩn bằng kỹ thuật ribotyping có một số ưu điểm so với một số kỹ thuật định typ khác ở chỗ:
Thực tế là các gene của ribosom khá bền do chúng nằm trên nhiễm sắc thể. Hầu hết các vi sinh vật đều chứa nhiều phiên bản của operon ribosom do đó khi lai với mẫu dò thích hợp thì kết quả là tạo ra một số mảnh lai có kích thước khác nhau. Hiện nay, nguồn rARN của E.coli đánh dấu là mẫu dò khá phổ biến đã được thương mại hoá.
Do tính đa dạng và phức tạp của kỹ thuật định typ theo ribosom do đó trên thực tế khi nhìn kết quả bằng mắt thường khó có thể phát hiện được sự khác nhau hay giống nhau giữa các chủng trong cùng một loài khi tiến hành nghiên cứu dịch tễ học trên diện rộng. Owen và cộng sự (1992) đã nghiên cứu khả năng trợ giúp của computer để so sánh kết quả thu được khi nghiên cứu các chủng Helicobacter pylori. Tương
tự như vậy Bialkowska-Hobranska và cộng sự (1990) dùng thiết bị laze đo mật độ các mảnh ADN lai cùng với sự trợ giúp của computer để phân tích các kết quả thu được từ các chủng cầu khuẩn nha bào gram âm. Phương pháp này có thể đưa ra số liệu chung làm cơ sở cho xác định sự giống nhau giữa các loài khác nhau. Các phân tích thu được từ các số liệu của các các thể khác nhau có thể chỉ ra được các cá thể mới làm cơ sở cho định danh cũng như theo dõi.
Mọi nghiên cứu cho thấy một điều quan trọng và có ý nghĩa nhất là cách chọn enzym cắt hạn chế và loại mẫu dò dùng cho phép lai (Saunder và cộng sự 1991).
Tóm tắt:
Nhìn chung phương pháp lai ADN chứng tỏ ưu thế của nó như là một kỹ thuật quan trọng cho định typ và nghiên cứu dịch tễ học nhiều loại vi sinh vật khác nhau. Về nguyên tắc phương pháp này cũng có ưu điểm và nhược điểm của nó.
Ưu điểm:
- Sử dụng cho nhiều đối tượng vi sinh vật.
- Có các mẫu dò vạn năng được bán rộng rãi trên thị trường. Kết quả lai có độ lặp lại cao và khá đơn giản cho việc phân tích kết quả.
- Có thể sử dụng sự trợ giúp của computer để lưu giữ và phân tích kết quả thí nghiệm.
Hạn chế:
- Phương pháp sử dụng khá phức tạp và tốn thời gian.
- Thông tin kết quả chỉ phản ánh cho đoạn gene lai với mẫu dò sử dụng. Hiện nay, có thể sử dụng các đoạn ADN tổng hợp làm mẫu dò và điều này thực tế đã làm cải thiện nhiều mặt của kỹ thuật lai như: khi có ADN tổng hợp thì không phải thực hiện các kỹ thuật tách và tinh sạch các mảnh ADN tách dòng có thể lẫn ADN plasmid. Mặt khác khi lai với mẫu dò tổng hợp thì phản ứng tiến hành nhanh với độ đặc hiệu cao hơn.
Cho dù kỹ thuật này được sử dụng tốt cho nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau nhưng năm 1992 Heimberger và cộng sự đã tiến hành phân tích ADN được xử lý với enzym cắt hạn chế trong trường xung điện (PFGE), kết quả này rất có ý nghĩa cho phép phân tích sâu hơn và phân biệt các chủng vi sinh vật liên quan đến sự bùng phát dịch đối với các chủng vi sinh vật khác.
Ribotyping và PFGE có chung nguyên tắc dựa vào sự phân bố của các vị trí enzym cắt hạn chế trên ADN của ribosom. Tuy nhiên, sự khác biệt ở chỗ ribotyping phản ánh sự phân bố của vị trí các enzym cắt hạn chế nằm trong các gene mã hoá cho rRNA hay nằm trong vùng nhiễm sắc thể có độ bảo thủ cao, còn đối với PFGE phản ánh sự phân bố của các enzym cắt hạn chế phân bố trên toàn bộ gene nghiên cứu. Nghiên cứu của Prevost (1992) cho thấy là kỹ thuật PFGE có thể hiệu quả hơn kỹ thuật ribotyping đối với phép phân tích các chủng Staphylococus aureus kháng methicillin.
2.3. Nhân gene và kỹ thuật giải trình tự ADN.
Kỹ thuật lai ADN đã được sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu xác định typ của nhiều đối tượng vi sinh vật. Nguồn ADN đích đôi khi chỉ có số lượng ít trừ khi các tiến hành nuôi cấy vi sinh vật. Trong một số trường hợp việc nuôi cấy không thể thực hiện được với nhiều loài vi sinh vật hay virút hoặc trong các trường hợp khác cần thời gian dài nuôi cấy vi sinh vật để có đủ ADN cho các kỹ thuật lai hay định typ. Khó khăn này được khắc phục bằng cách làm tăng nguồn ADN đích một cách nhanh chóng bằng kỹ thuật nhân gene PCR.
a. Kỹ thuật nhân gene PCR (Polymerase Chain Reaction)
Việc nhân ADN cho phép làm tăng số lượng gấp hàng triệu hoặc nhiều hơn nữa đối với đoạn ADN hay ARN nghiên cứu. Có nhiều phương pháp khác nhau để phân tích nguồn ADN khuyếch đại theo cách này. Phương pháp đơn giản nhất là sử dụng điện di để xác định kích thước sản phẩm của phản ứng PCR. Có thể xác định độ nhạy và tính đặc hiệu cao hơn nếu sản phẩm PCR được lai với mẫu dò đặc hiệu đã được đánh dấu. Phương pháp đưa lại thông tin nhiều nhất là xác định được trình tự ADN và ARN của sản phẩm PCR. Việc xác định được sai khác của chuỗi ADN sẽ cho phép xác định và định typ chính xác nhất các đối tượng vi sinh vật nghiên cứu. Kết quả xác định trình tự ADN còn cho phép xác định mối liên hệ tiến hoá và dịch tễ học của các chủng vi sinh vật.