2.2 PH ƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
2.2.6.Kh ảo sát sự thay đổi tỉ lệ đệm Na2B4O7 và dung môi Aceton
•Dung dịch các amino acid chuẩn (11 amino acid: Arg, Ser, Asp, Glu, Thr, Gly, Aba, Ala, Met ,Val và Leu) được hòa tan trong dung dịch Na2B4O7 0,2M (pH=9) .
•Dung dịch Dansyl clorur (Dns-Cl) 0,25%(mg/ml), 0,5%(mg/ml), 1,0%(mg/ml), được chuẩn bị bằng cách hòa tan Dansyl clorur (Merck) trong dung môi aceton (Merck).
2.1.3 Vật liệu
Trùn Quế (Perionyx excavatus ) được lấy từ trang trại nuôi trùn Quế ở trường
đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.
2.2 PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
2.2.1 Cách tiến hành phản ứng Dansyl hóa tạo dẫn xuất Dansyl của amino acid chuẩn
,5 ml dung dịch amino acid (chuẩn/mẫu) được pha trong đệm borat 0,
Cho 0 2M ở
pH 9 vào ống nghiệm, tiếp tục thêm 0,5 ml dung dịch thuốc thử Dansyl clorur 0 25%(w/v) pha trong aceton, ph, ản ứng được thực hiện ở 600C trong 30 phút.
2.2.2 Khảo sát điều kiện tối ưu để tiến hành phản ứng tạo dẫn xuất Dansyl
Khảo sát pH của phản ứng Dansyl hóa. Khảo sát nồng độ thuốc thử Dansyl clorur. Khảo sát thời gian của phản ứng Dansyl hóa.
Khảo sát sự thay đổi tỉ lệ dung môi aceton và đệm borat
2.2.3 Khảo sát pH của phản ứng Dansyl hóa
Để khảo sát pH của phản ứng Dansyl hóa, chúng tôi thực hiện phản ứng trong môi trường đệm Borat 0,2M với các pH khác nhau(pH=8;9;10) và các thông số khác như nồng độ Dansyl là 0,5 %, nhiệt độ phản ứng 600C, thời gian phản ứng 30 phút.
2.2.4 Khảo sát nồng độ thuốc thử Dansyl clorur
Thực hiện phản ứng Dansyl hóa 11 amino acid tại pH = 9 với nồng độ thuốc thử Dansyl clorur là: 0,25 %; 0,5%; 1,0%; còn các thông số khác như nhiệt độ phản
ứng 600C, thời gian phản ứng 30phút.
2.2.5 Khảo sát theo thời gian của phản ứng Dansyl hoá
Chúng tôi tiến hành khảo sát các thời gian khác nhau T=30, 60, và 90 phút của phản ứng Dansyl hóa, còn các thông số khác như nhiệt độ phản ứng 600C, pH=9 (của đệm Borat 0,2M), nồng độ Dansyl clorur 0,5%.
2.2.6Khảo sát sự thay đổi tỉ lệ dung môi Aceton và đệm Na2BB4O7
Chúng tôi tiến hành khảo sát ở ba loại tỉ lệ dung môi và đệm khác nhau như
bảng 3.5 còn các thông số khác như thời gian phản ứng là 30phút, pH=9 (của đệm borat 0,2M), nồng độ Dansyl clorur 0,5%(w/v).
2.2.7 Qui trình thủy phân trùn Quế bằng acid và phản ứng Dansyl hóa
Cân 0,1g trùn Quếđã sấy khô ( ở nhiệt độ 1100C trong 5h) cho vào ống Hach, thêm 3ml nước cất 2 lần và 3ml HCl đậm đặc. Lắc đều và dùng khí nitrogen thổi vào miệng ống trong 30giây để đuổi khí oxygen rồi đóng nắp lại. Đưa ống Hach vào lò nung COD đun tại 110oC trong 24h. Phần dung dịch còn lại cho vào bình định mức 25ml và định mức. Lọc qua màng lọc 0,45µm. Lấy 0,1ml dung dịch cho vào
ống Hach mới, thêm 0,2ml aceton vào và thổi khô bằng khí nitrogen. Sau khi thổi khô thêm 1ml dung dịch đệm borat 0,2M (pH=9,0), lắc đều. Thêm tiếp 1ml dung dịch Dansyl clorur (0,5 % w/v trong aceton). Đậy nút lại và cho ống Hach vào bể
nước 600C trong 30 phút. Sau 30 phút lấy ống Hach ra để nguội, thêm vào 1ml toluen và lắc đều, ly tâm, sau khi tách lớp rút bỏ toluen và thổi khô phần còn lại bằng khí nitrogen. Sau đó dùng 1ml pha động A để hòa tan sản phẩm Dansyl hóa. Dung dịch này được lọc qua màng lọc 0,45µm sau đó tiêm vào máy HPLC-UV.
2.2.8 Qui trình thủy phân trùn Quế bằng baz và phản ứng Dansyl hóa
Cân 0,1g trùn Quếđã sấy khô ( ở nhiệt độ 1100C trong 5 h) cho vào ống Hach, thêm 3ml nước cất 2 lần và 3ml NaOH 8 M . Lắc đều và dùng khí nitrogen thổi vào miệng ống trong 30giây để đuổi khí oxygen rồi đóng nắp lại. Đưa ống Hach vào lò nung COD đun tại 110oC trong 24h. Để nguội, lấy dung dịch đó cho vào bình định mức 25 ml và định mức. Lọc qua màng lọc 0,45µm. Lấy 0,1ml dung dịch cho vào
ống Hach mới, thêm 0,2ml aceton vào và thổi khô bằng khí nitrogen. Sau khi thổi khô thêm 1 ml dung dịch đệm borat 0,2M (pH=9,0), lắc đều. Thêm tiếp 1ml dung dịch Dansyl clorur (0,5% w/v trong aceton). Đậy nút lại và cho ống Hach vào bể
nước 600C trong 30phút. Sau 30phút lấy ống Hach ra để nguội, thêm vào 1ml toluen và lắc đều, ly tâm, sau khi tách lớp rút bỏ toluen và thổi khô phần còn lại bằng khí nitrogen. Sau đó dùng 1ml pha động A để hòa tan sản phẩm Dansyl hóa. Dung dịch này được lọc qua màng lọc 0,45µm sau đó tiêm vào máy HPLC-UV.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 NGHIÊN CỨU PHẢN ỨNG TẠO DẪN XUẤT DANSYL CỦA AMINO ACID CHUẨN
3.1.1 Cách tiến hành phản ứng Dansyl hóa
Lấy 0,5ml dung dịch Na2B4O7 0,2M (pH=9) có chứa các amino acid chuẩn (11 amino acid: Arg, Ser, Asp, Glu, Thr, Gly, Aba, Ala, Met ,Val và Leu) vào ống nghiệm, tiếp tục thêm 0,5ml dung dịch thuốc thử Dns-Cl 0,25% (2,5mg Dns-Cl /1ml acetone). Sau khi lắc đều, ngâm ống nghiệm này vào bể nước 60oC trong 30phút.
3.1.2 Khảo sát điều kiện tối ưu để tiến hành phản ứng tạo dẫn xuất Dansyl hóa
Các yếu tố như pH, nhiệt độ, thời gian phản ứng, nồng độ tác chất … đóng vai trò quan trọng trong phản ứng Dansyl hóa.
Trong các thí nghiệm khảo sát này, dung dịch chuẩn chứa 11 amino acid gồm Arg, Ser, Asp, Glu, Thr, Gly, Aba, Ala, Met ,Val và Leu. Mỗi amino acid nồng độ
xác định được pha trong hệ đệm Borat dùng để khảo sát điều kiện tối ưu tiến hành phản ứng Dansyl hóa. Sau đó, các dẫn xuất Dansyl được xác định bằng phương pháp HPLC tại bước sóng λ = 254nm, nhiệt độ cột phân tích 50oC.
5 % ACN, 5 % IPA, 90 % hệ đệm pH 2,8 của 0,1 % • Pha động A: (v/v) TFA, điều chỉnh pH với TEA. 40 % ACN, 40 % IPA, 20 % hệ đệm pH 1,8 của 0,14 • Pha động B: % (v/v) TFA, điều chỉnh pH với TEA.
Bảng 3.1: Chương trình gradient pha động A và B. T(phút) % A % B 0.0 100,0 0,0 20.0 85,0 15,0 25.0 59,0 41,0 30.0 50,0 50,0 33.0 0,0 100,0 3.1.3 Khảo sát pH của phản ứng Dansyl hóa
Đối với phản ứng Dansyl hóa, pH là yếu tố quan trọng và cần giữ cố định trong suốt thời gian phản ứng. Khi pH quá thấp nhóm amin của amino acid bị
proton hóa, còn khi pH quá cao ion OH- sẽ phản ứng với Dansyl clorur tạo thành Dansyl hydroxid. Để khảo sát pH chúng tôi thực hiện phản ứng Dansyl hóa trong môi trường đệm borat 0,2M với các pH khác nhau và các thông số khác như nồng
độ Dansyl là 0,5%, nhiệt độ phản ứng 600C, thời gian phản ứng 30 phút. Kết quả
thực nghiệm được nêu ở bảng 3.2 và hình 3.1.