Thời gian thực hiện đề tài trong 2 năm (2005-2006). Trong bỏo cỏo này chỳng tụi bỏo cỏo nội dung (1) trong toàn tiến trỡnh thực hiện đề tài: Nghiờn cứu kỹ thuật nuụi cấy tỏi sinh cõy thụng đỏ (Taxus wallichiana Zucc) in vitro
2.1. Vật liệu
- Mẫu nuụi cấy: cõy thụng đỏ đầu dũng được giõm cành trong bầu đất với nhiều độ tuổi khỏc nhau (Trung tõm Nghiờn cứu Lõm sinh ĐàLạt thu thập ở vựng nỳi Liang Biang, Lõm Đồng).
- Điều kiện nuụi cấy: mụi trường được vụ trựng ở 121oC, 1at, trong 25 phỳt. Nhiệt độ phũng nuụi cấy 28+1oC. Cường độ chiếu sỏng 34,2àmol/m2/s. Thời gian chiếu sỏng 8giờ/ngày
- Mụi trường nuụi cấy: mụi trường dinh dưỡng khoỏng cơ bản MS (Murashige-Skoog, 1962), WPM (Lloyd & McCown, 1981), WV3 (Coke, 1996), được bổ sung BA (6-benzylaminopurine), kinetin (6-fufurylaminopurine), IBA (β-indol butyric acid), NAA (α-naphthalen acetic acid). Chất chống húa nõu: than hoạt tớnh, PVP, AgNO3.
2.2. Phương phỏp
Thớ nghiệm được bố trớ theo RCBD, 4 lần lặp lại, 5 bỡnh tam giỏc cho một lần lặp lại, mỗi bỡnh cấy 5 mẫu. Số liệu được phõn tớch bằng phần mềm thống kờ MSTSC.
2.3. Kết quả và thảo luận
- Vụ trựng mẫu nuụi cấy: mẫu nuụi cấy được lấy từ cõy mẹ bầu đất 18 thỏng tuổi. Chồi đỉnh và chồi bờn được sử dụng làm mẫu nuụi cấy. Chồi non được vụ trựng
bằng hypochlorite Natri (10%) trong 15 phỳt. Chồi non vụ trựng được đưa vào nuụi cấy in vitro
- Ảnh hưởng của mụi trường khoỏng cơ bản đến nuụi cấy tỏi sinh chồi thụng đỏ in vitro: chồi no được nuụi cấy trờn mụi trường khoỏng cơ bản MS, WPM, WV3 cú bổ sung BA (5mg/l). Mụi trường MS tỏ ra thớch hợp
- Ảnh hưởng của chất chống húa nõu đến nuụi cấy tỏi sinh chồi thụng đỏ in vitro: cõy thụng đỏ thường tiết ra nhựa đỏ trờn vết thương. Sau khi nuụi cấy hồi non 2 ngày thỡ thấy xuất hiện nhựa đỏ tiết ra vào mụi trường làm hạn chế khả năng tỏi sinh chồi. Trờn mụi trường MS + BA(5mg/l) cú bổ sung than hoạt tớnh, PVP hay AgNO3. Kết quả nghiờn cứu cho thấy than hoạt tớnh (1000mg/l), PVP (150mg/l) và AgNO3 (150mg/l) đó hạn chế rừ rệt sự tiết nhựa vào mụi trường nuụi cấy. Trong đú AgNO3 tỏ ra hiệu quả hơn
- Ảnh hưởng của sinh lý mẫu nuụi cấy đến tỏi sinh chồi thụng đỏ in vitro: sinh lý mẫu nuụi cấy cú ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tỏi sinh chồi bờn và chồi bất định in vitro. Cú nhiều loạ mẫu được đưa vào nuụi cấy: (1) ngọn chớnh + đốt 1, (2) thõn chỡnh + đốt 2, (3) thõn chớnh + đốt 3, (4) ngọn cành + đốt 1, (5) thõn cành + đốt 2, (6) thõn cành + đốt 3. Mẫu được nuụi cấy trờn mụi trường MS + BA(5mg/l) + AgNO3(150mg/l). Kết quả cho thấy mẫu (1) và (2) cú số chồi / mẫu cao hơn cả 1,5 và 3
- Ảnh hưởng của tuổi mẫu nuụi cấy đến tỏi sinh chồi thụng đỏ in vitro: tuổi mẫu nuụi cấy cú vai trũ quan trọng, mẫu phải non, và đủ độ tuổi chớn sinh lý, sẽ cho phỏt sinh chồi cao. Mẫu nuụi cấy cú tuổi sinh lý 12-15-18 thỏng tuổi, được nuụi cấy trờn mụi trường MS + BA(5mg/l) + AgNO3(150mg/l). Kết quả nghiờn cứu cho thấy, tỷ lệ chồi tỏi sinh cao nhất với tuổi mẫu 18 thỏng, phỏt sinh số chồi / mẫu nuụi cấy cao (3,1 chồi)
- Ảnh hưởng của BA đến tỏi sinh chồi thụng đỏ in vitro: mụi trường dinh dưỡng khoỏng cơ bản cú bổ sung BA(0,5-2,5-5-10-15mg/l) + AgNO3(150mg/l). Kết quả nghiờn cứu cho thấy BA(5mg/l) thớch hợp cho nuụi cấy tỏi sinh chồi
- Ảnh hưởng của BA và Kinetin đến tỏi sinh chồi thụng đỏ in vitro: nhằm nõng cao khả năng nuụi cấy tỏi sinh chồi, tổ hợp BA(5mg/l) + Kinetin(0,1-0,5-1-2,5-5mg/l) + AgNO3(150mg/l) được bổ sung vào mụi trường nuụi cấy MS. Kết quả cho thấy, tổ hợp MS + BA(5mg/l) + K(1mg/l) + AgNO3(150mg/l) thớch hợp cho nuụi cấy tỏi sinh chồi, cho số chồi / mẫu nuụi cấy nhiều (3,1 chồi)
- Ảnh hưởng của mẫu nuụi cấy đến tỷ lệ ngó nghiờng chồi thụng đỏ in vitro: cõy thụng đỏ cú đặc tớnh khi giõm cành bờn ngoài vườn ươm thường cú tỷ lệ cõy ngó nghiờng cao. Mụi trường nuụi cấy tỏi sinh chồi: MS + BA(5mg/l) + K(1mg/l) + AgNO3(150mg/l). Mẫu nuụi cấy: (1) đỉnh thẳng đứng (2) thõn thẳng đứng (3) đỉnh cành (4) thõn cành. Kết quả nghiờn cứu cho thấy, tỷ lệ ngó nghiờng cao khi mẫu nuụi cấy là (3) và (4) so với độ thẳng đứng của trục tung (0o) là >45o, mẩu (1) và (2) cú tỷ lệ ngó nghiờng <45o. Mẫu nuụi cấy thớch hợp cho tỏi sinh chồi in vitro là (1) đỉnh thẳng đứng và (2) thõn thẳng đứng
- Ảnh hưởng của tớnh bảo lưu cục bộ đến sinh trưởng chồi thụng đỏ in vitro: trong giõm cành, với mẫu là cành (nhỏnh) bờn, thường cho cõy ngó nghiờng. Nghiờn cứu tớnh bảo lưu cục bộ in vitro cho thấy: trờn mụi trường nuụi cấy MS + BA(5mg/l) +
AgNO3(150mg/l), với mẫu nuụi cấy (1) đỉnh cành (2) thõn cành, cho kết quả: gúc nghiờng so với trục tung (0o), mẫu nuụi cấy (1) cú tỷ lệ ngó nghiờng thấp nhất
- Ảnh hưởng của điều kiện nuụi cấy thụng khớ và ỏnh sỏng đến sinh trưởng chồi thụng đỏ in vitro: trờn mụi trường nuụi cấy MS + BA(5mg/l) + AgNO3(150mg/l), mẫu nuụi cấy là thõn chớnh + đốt 2, bỡnh tam giỏc được đậy kớn bằng nắp giấy và nắp cao su, trong điều kiện chiếu sỏng 11,4-22,8-34,2àmol/m2/s. Kết quả cho thấy trong điều kiện chiếu sỏng 11,4-22,8àmol/m2/s và đậy bằng nắp giấy cho phỏt sinh chồi / mẫu cao (2,8 chồi)
- Nhõn nhanh cõy thụng đỏ in vitro: chồi non phỏt sinh trong nuụi cấy được sử dụng làm protocol cho quỏ trỡnh vi nhõn giống. Trờn mụi trường cơ bản MS cú bổ sung BA v à K. Kết quả cho thấy mụi trường nhõn nhanh hiệu quả là MS + BA(5mg/l) + K(1mg/l) cho phỏt sinh chồi / cụm cao (3,4 chồi). Cõy thụng đỏ in vitro cú tớnh ưu thế ngọn mạnh mẽ, nuụi cấy đốt thõn cho phỏt sinh chồi bờn, nuụi cấy chồi ngọn chỉ cho vươn thõn chồi
- Nuụi cấy phỏt sinh rễ chồi thụng đỏ in vitro: cõy con thụng đỏ phỏt sinh rễ in vitro trờn mụi trường nuụi cấy WPM + NAA(3mg/l) + Rhizopon(50mg/l) sau 75 ngày nuụi cấy.
2.4. Kết luận
Cõy thụng đỏ được nghiờn cứu tỏi sinh và nhõn nhanh in vitro nhằm mục tiờu bảo tồn nguồn gen quý hiếm đang bị tuyệt diệt