2.2.8.1. Tách chiết DNA tổng số
Tế bào nấm sợi đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng Czapek ở 30C, lắc 200 vòng/phút, sau 96 giờ dịch nuôi đƣợc ly tâm 10 phút với 10000 vòng/phút. Tủa tế bào đƣợc nghiền nhẹ trong nitơ lỏng, sau đó bổ sung 600 µl đệm phá tế bào lắc nhẹ và 65 µl lysozyme, ủ 45 phút ở 37°C. Sau đó hỗn hợp đƣợc bổ sung 5 µl protease K ủ 2-3 giờ ở 56°C. Bổ sung chloroform : isoamyl alcohol (24:1) với tỷ lệ 1:1 và ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C. 500 µl dịch nổi phía trên đƣợc thu sang ống eppendorf mới và bổ sung isopropanol tỷ lệ 1:1 để ở -20°C trong 2 giờ. Tủa sau khi ly tâm 15 phút ở 4°C với 12000 vòng/phút đƣợc làm khô dƣới ánh sáng đèn và bổ sung 500 µl ethanol 70% để rửa DNA, loại muối và isopropanol. Sau khi ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, tủa đƣợc làm khô và hòa trong 40 µl đệm TE và bảo quản ở -20°C (Sandgren et al., 2003).
2.2.8.2. Khuếch đại gene bằng PCR
Để khuếch đại đoạn gene 28S rRNA từ chủng nấm A. oryzae VTCC-F- 045 cặp mồi NL1 (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3') và NL4 (5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3') đƣợc sử dụng.
Nhiệt độ gắn mồi của cặp NL1 và NL4 là 50°C. Hỗn hợp phản ứng PCR gồm: 1 µl mồi mỗi loại; 2 µl dNTP; 2,5 µl MgCl2 25 mM; 2,5 µl đệm PCR 10x; 0,35 µl Taq; 1 µl khuôn DNA và bổ sung H2O cất tiêm lên tổng thể tích 25 µl.
Phản ứng đƣợc thực hiện ở điều kiện: 95°C/5 phút, 35 chu kỳ (95°C/1 phút; 52°C/1 phút; 72°C/1 phút); 72°C/10 phút.
2.2.8.3. Gắn dính sản phẩm PCR vào pJET1.2
Phản ứng gắn dính sản phẩm PCR vào vector tách dòng pJET1.2 đƣợc thực hiện theo bài thí nghiệm (Fermentas). Hỗn hợp gồm 5 µl đệm 2x; 1,5 µl sản phẩm PCR; 0,5 µl enzyme blunting; 2,5 µl H2O và hỗn hợp đƣợc ủ ở 70°C trong 15 phút. Bổ sung 0,5 µl pJET1.2 và 0,5 µl T4 DNA ligase rồi ủ qua đêm ở nhiệt độ 22°C tạo plasmid tái tổ hợp.
2.2.8.4. Biến nạp plasmid hóa học
Plasmid đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α theo phƣơng pháp sốc nhiệt và hóa học. Một khuẩn lạc E. coli đƣợc cấy chuyển vào 3 ml môi trƣờng LB, lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Một trăm ml môi trƣờng LB đƣợc tiếp giống với 1 ml dịch tế bào qua đêm, nuôi lắc ở 37°C với 200 vòng/phút. Khi OD600nm đạt 0,4-0,6 (khoảng 2-3 giờ nuôi cấy), dịch nuôi cấy đƣợc đặt vào đá lạnh 1 giờ, rồi ly tâm 10 phút ở 4°C với 6000 vòng/phút. Tủa tế bào đƣợc hòa đều trong 100 ml dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh và vô trùng, ủ đá 15 phút và ly tâm nhƣ trên. Tủa tế bào lại đƣợc hòa đều trong 40 ml CaCl2 100 mM lạnh vô trùng, ủ đá khoảng 1 giờ và ly tâm 10 phút với 4000 vòng/phút. Tủa tế bào lại đƣợc hòa vào 500 μl dung dịch 100 mM CaCl2
lạnh, vô trùng chứa 15% glycerol. Dịch hỗn hợp tế bào và glycerol đƣợc chia nhỏ vào các ống eppendorf, dùng để biến nạp ngay hoặc bảo quản ở -84°C.
Năm μl plasmid tái tổ hợp đƣợc trộn với 40 μl dịch tế bào làm khả biến, ủ 20-30 phút ở 4°C. Hỗn hợp đƣợc sốc nhiệt 45 giây ở 42°C. Sau đó đặt ngay vào đá lạnh 5 phút rồi bổ sung 250 μl môi trƣờng LB đã khử trùng. Sau khi nuôi lắc hỗn hợp khoảng 60 phút ở 37°C với 200 vòng/phút, 50-200 μl dịch tế
bào đã biến nạp đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc chứa kháng sinh ampinillin ủ qua đêm ở 37°C.
2.2.8.5. Tách chiết DNA plasmid
Một khuẩn lạc đã đƣợc biến nạp trên đĩa thạch đƣợc cấy vào 3 ml môi trƣờng LB chứa ampicillin, nuôi lắc qua đêm ở 37°C, 200 vòng/phút. Dịch tủa tế bào thu đƣợc sau khi ly tâm 5 phút với 6000 vòng/phút đƣợc lắc rung 30 giây trong 150 µl Sol I thành dịch đồng nhất, ủ 15-20 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó 150 µl Sol II đƣợc bổ sung vào hỗn hợp và đảo nhẹ, tiếp tục bổ sung 150 µl Sol III vào hỗn hợp đảo nhẹ. Hỗn hợp đƣợc bổ sung 450 µl chloroform/isoamyl alcohol 24:1, lắc nhẹ và ly tâm 10 phút với 12500 vòng/phút trong. 450 µl pha trên đƣợc hút sang ống mới, bổ sung 320 µl isopropanol, lắc nhẹ và ủ 5 phút ở -80°C để tủa DNA plasmid. Tủa DNA plasmid sau khi ly tâm 12500 vòng/phút trong 5 phút đƣợc rửa với 500 µl 70% ethanol ở 4°C để loại muối và isopropanol, làm khô trong không khí ở nhiệt độ phòng. Tủa plasmid đƣợc hòa trong đệm TE pH 8,0 hoặc nƣớc khử ion vô trùng và điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid rồi bảo quản ở -20°C.
2.2.8.6. Cắt DNA tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn
DNA plasmid tái tổ hợp đƣợc cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn XhoI và
XbaI qua đêm ở 37C để kiểm tra phân đoạn chèn. Hỗn hợp phản ứng gồm 3,5 µl DNA plasmid tái tổ hợp; 0,25 µl enzyme giới hạn mỗi loại; 2 µl đệm Tango Y+ và bổ sung H2O cất tiêm đến 10 µl. Sau phản ứng, sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel 0,8% agarose để kiểm tra.
2.2.8.7. Giải trình tự nucleotide
Sau khi tinh sạch plasmid tái tổ hợp, đoạn DNA chèn vào plasmid đƣợc giải trình tự nucleotide theo nguyên lý của phƣơng pháp Sanger cải tiến dựa trên các dideoxy. DNA polymerase xúc tác gắn các dideoxynucleotide vào
đầu 3'-OH mạch đơn DNA đang tổng hợp, quá trình tổng hợp sẽ dừng lại khi gặp dideoxynucleotide đánh dấu huỳnh quang không có nhóm 3'-OH. Kết quả là hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng bao gồm các polynucleotide có kích thƣớc hơn kém nhau một nucleotide và đƣợc phát hiện bằng mẫu dò huỳnh quang trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Vector pJET1.2 đƣợc gắn hai trình tự mồi xuôi và mồi ngƣợc M13 (-20) để đọc trình tự phân đoạn chèn DNA ngoại lai.
Kết quả đọc trình tự đƣợc phân tích, xử lý bằng phần mềm DNAStar để so sánh trình tự nucleotide, tính khoảng cách di truyền và xây dựng cây phân loại.
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN