− Sự lên men theo nghĩa rộng là quá trình trao đổi chất qua đó các chất hữu cơ mà trước tiên là đường bị biến đổi dưới tác dụng của các enzyme của vi sinh vật.
− Từ năm 1803 L.J.thenard chứng minh rằng nấm men là nguyên nhân trực tiếp của quá trình lên men rượu. Đến năm 1810 được Gay- lussac viết thành phương trình là:
L.Pasteur là nhà Bác học Pháp đã có nhiều công trình nghiên cứu về nấm men và sự lên men rượu. Năm 1857 Pasteur đã chỉ ra rằng: “sự phân giải đường thành rượu và CO2 là sự hô hấp của nấm men trong điều kiện yếm khí”. Tuy vậy thời đó Pasteur đã có những quan điểm sai lầm “ sự lên men chỉ xảy ra trong tế bào men sống” về sau Buchner đã nghiên cứu bổ sung hoàn chỉnh bản chất quá trình lên men rượu qua thí nghiệm lên men rượu dịch nghiền tế bào nấm men ông đã đưa ra kết luận chính xác như sau về sự lên men rượu: “sự lên men rượu là sự phân giải các chất đường thành rượu và CO2 dưới tác dụng của các chất do nấm men tiết ra”
− Các phản ứng hóa sinh trong quá trình lên men là phản ứng tách và vận chuyển hidro ở dạng (H+,+e) dưới tác dụng của các enzyme dehydrogenase. Trong quá trình đó hidro được tách ra khỏi cơ chất đến chất nhận điện tử cuối cùng là chất hữu cơ. Hợp chất hữu cơ đó được khử tạo thành sản phẩm lên men rồi tích tụ lại trong môi trường dinh dưỡng. Tùy theo sản phẩm tích lũy nào chiếm ưu thế mà ta có thể lên men rượu hoặc là lên men Lactic…
− Vì vậy bản chất của quá trình lên men là quá trình oxy hóa khử nó lại xảy ra trong cơ thể vi sinh vật dưới tác dụng của hệ thống enzyme, cho nên quá trình lên men còn được gọi là quá trình oxy hóa khử sinh học.
Ví dụ: Quá trình tạo thành ethanol trong tế bào nấm men.
C6H12O6 Glucose NAD
Quá trình oxy hóa NADH2
Acid pyruvic CH3-C-COOH
CH3-CHO CH3CH2OH
Acetaldehyde Quá trình khử Ethanol O
1.5.1.2. Quá trình hoá học của sự lên men (a) (b)
Hình 1.3: Sơ đồ lên men ethanol [3]
1.5.1.3. Các thời kì lên men ethanol [3]
Xét về mặt hóa học, lên men ethanol bình thường chia làm hai thời kỳ:
− Thời kỳ cảm ứng: Là thời kỳđầu hướng phản ứng xảy ra theo chiều hướng (a). Lúc này sản phẩm hình thành glycerin. Bởi lẽ lúc này hàm lượng acetaldehyde (CH3CHO) chưa có nhiều để tiếp nhận hyđro của acoldehydrogenase mà hyđro lại chuyển đến cho photphoglyceraldehyde tạo thành phosphoglyceryl, sau đó phosphoglycerin bị thủy phân giải phóng acid phosphoric và glycerin.
− Thời kỳ tĩnh: Lúc này lượng acetaldehyde đã hình thành nhiều, nên hydro từ alcoldehydrogenase lại chuyển sang acetaldehyde theo chiều hướng phản ứng (b). Lúc này sản phẩm chủ yếu là ethanol. CH3-CH2OH Ethanol -CO2 C6H12O6 Glucose CH2-O-PO3H2 CHOH CHO Phosphoglyceraldehyde Phosphoglyceryl CH2-O-PO3H2 CHOH CH2OH - H3PO4 CH2-O-PO3H2 CHOH COOH Phosphoglyceric CH3-CHO Acetaldehyde CH2OH Glycerin CHOH CH2OH
1.5.1.4. Diễn biến của quá trình lên men [3]
Trong quá trình lên men ethanol đầu tiên tế bào nấm men hấp thụ đường và chất dinh dưỡng khác lên bề mặt của nó. Sau đó các chất khuếch tán qua màng bán thấm của tế bào vào trong tế bào. Sự khuếch tán này tuân theo định luật chung của sự thẩm thấu. Nước có thể ra vào tự do nhưng đường và các chất hòa tan khác ra vào tế bào rồi thì không quay ra được. Trong nguyên sinh chất của tế bào nấm men, đường được chuyển hóa thành ethanol và CO2. Ethanol và CO2 được tạo thành thoát ra khỏi tế bào và khuếch tán vào môi trường, ethanol hòa tan vào trong nước. Lúc này môi trường lên men nhanh chóng được bão hòa bởi khí CO2, khí CO2 hấp phụ trên bề mặt của tế bào nấm men tạo thành như một cái phao, thắng được trọng lực của tế bào cả bọt khí và nấm men nổi lên. Bọt khí vỡ, tế bào nấm men lại chìm xuống. Như vậy nếu quan sát vào môi trường lên men ta thấy nấm men vốn không di động trở thành di động. Hiện tượng này góp phần tăng nhanh quá trình trao đổi chất và tốc độ lên men được tăng nhanh một cách tương ứng.
1.5.1.5. Sự hình thành các sản phẩm phụ trong quá trình lên men
Khi lên men bên cạnh sản phẩm chính là rượu ethanol và CO2 còn có nhiều các sản phẩm phụ khác như: acid acetic, glycerin, acetaldehyde, dầu fusel. Tỷ lệ các sản phẩm phụ này phụ thuộc vào điều kiện của môi trường lên men.
− Sự hình thành glycerin
Trong điều kiện bình thường, khi pH môi trường từ 4-5 thì sự lên men có thể giải thích bằng phương trình sau:
pH= 4-5
C6H12O6 CH3CHO + CO2 + C3H8O3
Còn trong môi trường kiềm, đường chuyển hoá tạo rượu etylic, glycerin, acid acetic với lượng tương đương nhau.
pH > 7
− Sự tạo thành dầu fusel
Trong các sản phẩm phụ không thể không kểđến dầu fusel. Đây là hỗn hợp các loại rượu bậc cao một nhóm định mức như Butanol, Isobotanol, Pentanol, Isopentanol.
Từ đầu thế kỷ 20 các nhà chuyên môn cho rằng dầu fusel tạo thành do nấm men sử dụng đạm ở dạng NH3 của các aminoacid ở trong dịch đường lên men.
-2H +H2O
R – CH – COOH R – C – COOH R – C – COOH - NH3
NH2
-CO2
+CO2
R - CH2OH R – CHO
Theo cơ chế tạo dầu fusel từ acid amin theo phương trình sau:
R – CH2NH2 R – CH2OH -CO2 R – CH – COOH +H2O NH2 -NH2 -CO2 R – CHOH – COOH R – CH2OH NH O
Theo Neibayep và Froxmere cơ chế tạo dầu fusel như sau:
-NH3 -CO2
R – CH – COOH R – C – COOH R – CH2OH NH2 ½ O2 NH +H2
Theo nghiên cứu mới nhất đã cho thấy rằng lượng dầu fusel trong rượu vang đạt từ 300- 500 mg/l.
Nếu có thể lên men từđường và dùng nguồn nitơ vô cơ thì vẫn có dầu fusel tạo thành. Như vậy họđã chứng minh được rằng dầu fusel tạo thành trong dịch lên men phần lớn là từđường hay nói đúng hơn là từ các hợp chất trung gian của đường.
Cơ chế tạo dầu fusel như sau Cơ chế của phản ứng tạo Isobutanol − Cơ chế phản ứng tạo Isopentanol. CH3 – C – C - COOH CH3 CH3 – CO – COOH + CH3CHO O OH Acid pyruvic Acetaldehyde
CH3 – CH – CHO CH3 CH3–CH2–CH2OH CH3 Isobutanol CH3 – CH – C - COOH CH3 O CH3 O + CH3~ CoA CH3 – CH – CH2 – CH2OH CH3 CH3 O CH3 – CH – CH2 – C – COOH CH3 – CH – C – COOH
− Sự hình thành este
Este được tạo thành trong quá trình lên men vang một lượng đáng kể và chúng là những hợp chất quan trọng hình thành hương vị của vang. Trong số này có etylaxetat là vượt trội hơn cả về số lượng. Este etylbutyrat cũng giống như este của các rượu bậc cao có mùi hoa quả. Sự tạo thành những este phức tạp do các giống và các loài nấm men khác nhau là không đồng nhất như nhau. Ví dụ: S.oviformis tổng hợp được nhiều etyaxetat trong điều kiện kỵ khí: 80 mg/l, trong hiếu khí là: 40 mg/l và izoamylaxetat trong kỵ khí là: 1,21 mg/l và trong hiếu khí là 0,14 mg/l. S.vini
trong điều kiện kỵ khí tương ứng là 0,62 mg/l, trong điều kiện hiếu khí 0,13 mg/l. Ngưỡng cảm nhận được của etyaxetat có trong vang là 180 ÷ 200mg/l. Nếu thấp hơn hay cao hơn khoảng này đều ảnh hưởng đến vị của vang. Trường hợp cao hơn sẽ làm vang có vị đắng gắt khó chịu. Trong lên men vang tích tụ các este có nhiệt độ sôi thấp và độ sôi cao (este etyl của các axit caprotanic, caprilatic, caprinic, izoamulcapronic và của các acid béo linolevic, linolenovic và v.v …). Lên men ở điều kiện kỵ khí mức độ tạo este tạo thành lớn gấp 6 lần so với lên men ởđiều kiện hiếu khí. Giữ vang non được lên men trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí sẽ dẫn đến thay đổi nồng độ phần trăm của các este có độ sôi cao và làm tăng este có độ sôi thấp, ngược lại vang non được lên men ở dư áp suất CO2 sẽ làm cho hàm lượng phần trăm các este có độ sôi cao nhiều hơn. Trong nồng độ nhất định các este làm cho mùi vị của vang mềm mại hơn, dịu dàng và hài hòa hơn.
− Sự hình thành acid hữu cơ
Nghiên cứu của Tbaragie (1936) chỉ ra rằng khi acid acetic bị mất hydro và ngưng tụ thành acid succinic.
Theo M.Lapon (1955) khi thêm vào dịch lên men acid glutaric thì thấy rằng: chỉ một lượng acid glutaric tạo thành acid succinic. Điều đó chứng tỏ rằng phần lớn acid succinic được tạo thành từ đường chứ không phải từ acid amin theo cơ chế Erlix.
C6H12O6 + C5H7O4NH2 + 2H2O C4H6O4 + 2C3H8O3 + CO2 + NH3
Ngoài ra sự tạo thành các acid hữu cơ còn do quá trình chuyển amin trong dịch mà nên.
− Sự tạo thành acetoin, diacetyl và 2,3 butadiol
Ba hợp chất này được tạo thành trong công đoạn lên men chính bởi hoạt động của tế bào nấm men. Trong ba chất này độc hại và nguy hiểm nhất là diacetyl, đây là chất lỏng không màu đến màu vàng nhạt, có mùi hôi cực mạnh, vị đắng gắt rất khó chịu tác động đến hệ thần kinh con người. Nếu xem acid pyruvic là điểm xuất phát thì cơ chế tạo thành 3 chất này như sau:
CH3 – CO – COOH CH3 – CHO + CO2
Acid pyruvic Acetaldehyde
CH3 – CHO + CH3 – CHO CH3 – CO – CHOH – CH3
Acetaldehyde Acetoin
+2H
CH3 – CO – CHOH – CH3 CH3 – CHOH – CHOH – CH3 - 2H 2,3 Butadiol
-2H CH3 – CO – CHOH – CH3 CH3 – CO – CO – CH3
+2H Diacetyl
− Sự tạo thành aldehyt
Aldehyt là sản phẩm được tạo thành trong quá trình trao đổi chất của nấm men cũng có thể được tạo thành qua con đường oxi hóa rượu. Trong quá trình lên men hàm lượng acetaldehyt chiếm cao nhất (xấp xỉ 90 mg/l). Tổng lượng aldehyt trong rượu dao động từ 35 ÷ 150 mg/l, ởđiều kiện yếm khí lượng acetaldehyt tạo thành ít hơn so với điều kiện hiếu khí. Ở lượng vừa phải, Aldehyt làm tăng thêm hương cho rượu nhưng nếu nhiều quá thì chúng làm ảnh hưởng xấu đến chất lượng vang vì aldehyt là một chất độc.
Trong giai đoạn lên men phụ hàm lượng Aldehyt giảm đi rất nhiều. Cụ thể như sau:
1.5.2. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN [2] [3] [4] [4]
1.5.2.1. Ảnh hưởng của nồng độđường
− Nấm men phải đòi hỏi những điều kiện nhất định để lên men. Trong sản xuất ngoài việc lựa chọn chủng nấm men còn phải nghiên cứu tạo điều kiện thích hợp đểđạt hiệu suất lên men cao.
− Nấm men chỉ có khả năng lên men các đường đơn giản như mono hay disacharid đặc biệt là maltose và saccharose. Sự chuyển hóa các disacharid này thành frutose được thực hiện bởi các enzyme maltoase và saccharoase mà tế bào nấm men có.
− Nấm men Saccharomyces cerevisiae hoàn toàn không có khả năng thủy phân tinh bột. Nếu nguyên liệu là tinh bột trong sản xuất rượu thì phải có quá trình thủy phân tinh bột trước khi lên men.
− Trong dịch men ngoài đường phải có thêm một số thức ăn cần thiết cho nấm men như các muối amon, các muối photphat và chủ yếu là đạm.
− Nồng độ đường ảnh hưởng đến năng lực lên men (năng lực lên men là khả năng cuả một lượng nấm men nhất định, lên men sau một thời gian nhất định được một lượng đường nào đó).
− Nồng độ đường thích hợp nhất là 10% ÷ 18% nếu cao hơn năng lực lên men giảm. Và ngược lại nếu nồng độ đường thấp sẽ không tạo cho quá trình lên men kém vì lượng đường thấp sẽ không đủđường cung cấp cho quá trình lên men. Trong thực tếở nồng độ 30 ÷ 35% thì sự lên men bị đình chỉ cho dù có loại nấm men có khả năng lên men được ở nồng độđường lên đến 60%.
−Trong dịch quả lượng đường không lên men tới 20% tổng lượng đường. Như vậy nồng độ đường sót lại khá cao trong lên men. Nó sẽ làm ức chế sự tạo thành rượu.
− Ảnh hưởng của nồng độ đường trong môi trường đến việc tạo thành rượu như sau:
Bảng 1.4: Mối quan hệ giữa nồng độ đường và thể tích rượu tạo thành [6]
Nồng độđường % 37 42 47 55 75 Lượng rượu tạo thành %V 8,6 6,3 5,9 3,4 0
− Ngừng trệ lên men trong nồng độ đường cao liên quan đến giống men có khả năng vượt quá áp suất thẩm thấu của dịch đường.
− Để hoạt động bình thường nấm men cần ở trong dung dịch có áp suất thẩm thấu thấp hơn áp suất có trong không bào.
Như vậy nồng độ đường ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng sản phẩm. Nếu nồng độ đường cao sẽ làm ức chế hoạt động của nấm men. Làm cho hàm lượng đường sót lại cao, lượng ethanol hình thành ít làm cho chất lượng của rượu giảm. Nếu nồng độ đường thấp sẽ không đủ cơ chất thực hiện trong quá trình lên men lượng ethanol tạo thành ít, làm cho nồng độ cồn thấp nên chất lượng rượu vang giảm. Trong thí nghiệm cũng như trong sản xuất cần phải nghiên cứu kỹ nồng độ đường phù hợp để có được chất lượng rượu vang tốt nhất.
1.5.2.2. Ảnh hưởng của pH môi trường
Trị số pH ảnh hưởng rất lớn đến đời sống nấm men. Độ pH của dịch quả là 2,8÷3,8. Tùy thuộc từng loại quả khác nhau sẽ có hàm lượng axít khác nhau, tức giá trị pH khác nhau và ở từng giai đoạn sinh trưởng, giai đoạn chin khác khác nhau thì độ pH cũng khác nhau.
Nếu nâng cao độ chua môi trường tức pH hạ xuống nấm men sẽ thay đổi hình thái tế bào nhỏ hơn, dạng cầu vượt trội trong tế bào tích tụ chất béo.
− pH thích hợp của lên men là 3,2 ÷ 4,1 tạo điều kiện để nấm men phát triển bình thường và tạo ra rượu đạt được về số lượng và chất lượng tốt nhất.
− Do đó nấm men hoạt động bình thường ở những khoảng pH thích hợp. Vì vậy trong quá trình lên men phải điều chỉnh pH thích hợp đối với từng loại nấm men nhằm tạo điều kiện để nấm men sinh trưởng và phát triển tốt.
Như vậy muốn nâng cao chất lượng sản phẩm cần phải điều chỉnh pH thích hợp để nấm men sinh trưởng và phát triển tốt. Việc điều chỉnh pH trong dung dịch lên men là cần thiết để tạo ra nhiều rượu có chất lượng tốt.
1.5.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ
− Nhiệt độ: là yếu tố rất quan trọng đối với nấm men nói chung và lên men vang nói riêng. Nó có tác dụng rõ rệt đến khả năng lên men của chủng nấm men và chất lượng của rượu vang (độ rượu, đường sót, chất thơm…). Lên men rượu vang thường thực hiện ở khoảng nhiệt độ 10 ÷ 300C. Nhiều nghiên cứu đã xác định được rằng cũng đã xác định được rằng, ở nhiệt độ cao lên men bắt đầu sớm, xảy ra mạnh mẽ, nhưng dễ bị dừng lại giữa chừng và kết thúc lên men khi đường sót còn lại ở dịch lên men là khá lớn, dễ được vi khuẩn lactic sử dụng. Do vậy, trong vang có nhiều acid lactic và acid axetic. Ngoài ra trong dịch quả có sẵn fructose tạo điều kiện cho vi khuẩn lactic sử dụng và tạo thành rượu C6 – mannit và axit axetic. Những chất này với đường sót làm cho rượu vang có vị chua, ngọt khó chịu. Nhiệt độ càng cao càng tạo điều kiện kỵ khí cho lên men chính, nhưng lại gây khó khăn cho lên men thứ cấp (lên men phụ) từ các đường sót, đặc biệt là men được tiến hành không có oxi không khí, với hàm lượng ban đầu lên men tương đối cao. Nhiệt độ không những đến cường độ lên men, tốc độ sinh sản của men giống mà còn ảnh hưởng đến sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp. Cho nên mỗi loại vang cần phải có