2.1.1.Quy trình chung Nước thải Lõi bắp Nước Bắp Hấp Làm nguội Rửa sạch Bào mỏng Lọc Gieo men Lên men Men Bã bắp Rượu bắp Hãm cồn Rượu gạo
a/Nguyên liệu
Bắp đường được mua ở chợ Nguyễn Tri Phương. Rượu gạo được mua từ nhà máy rượu Bình Tây. b/Nguồn giống
Sử dụng men ngọt được sản xuất theo phương pháp truyền thống. Men được mua ở chợ Nguyễn Tri Phương.
c/Cách tiến hành quy trình thí nghiệm
Nguyên liệu bắp đường được rửa sạch nhằm loại bỏ đất cát, lá và râu bắp còn sót lại. Sau đó, bắp đường được bào mỏng bằng dao bào để quá trình hấp diễn ra nhanh hơn và nấm men được tiếp xúc nhiều hơn với bắp giúp thuận lợi cho quá trình lên men.
Bắp sau khi bào mỏng được đem đi hấp ở nhiệt độ 100oC trong 1 giờ. Trong quá trình hấp, tinh bột bắp được hồ hóa giúp cho enzyme dễ dàng thủy phân tinh bột.
Sau khi hấp, bắp được làm nguội về nhiệt độ phòng (28oC) vì nhiệt độ của bắp sau khi hấp rất cao nếu cho nấm men vào sẽ giết chết nấm men hoặc làm giảm khả năng lên men của nấm men. Để làm bắp mau nguội, ta trải bắp ra khay.
Bắp sau khi làm nguội ta tiến hành gieo men: men được nghiền mịn và rải đều vào bắp. Trong lúc gieo men luôn đảo đều tay để men được tiếp xúc đều hoàn toàn với bắp để quá trình lên men tối ưu.
Sau quá trình lên men (120 giờ), nồng độ cồn của rượu bắp khoảng 8,5%v/v. Với nồng độ cồn thấp như vậy rất dễ bị oxy hóa tiếp để tạo thành CO2
và H2O với sự có mặt của nhóm vi khuẩn acetic nên chúng tôi tiến hành hãm cồn (thêm cồn tinh khiết) sau quá trình lên men vừa tránh oxi hóa cồn vừa tăng độ cồn cho rượu bắp.
Lọc hỗn hợp lên men qua vải lọc nhằm thu hồi dung dịch rượu, có thể ép chặt khối bã để thu được nhiều dịch hơn. Bã bắp có thể dùng làm thức ăn cho gia súc.
2.1.2.Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của lượng giống, thời gian lên men sau khi cố định hàm ẩm đến pH, mật độ tế bào, hàm lượng tinh bột còn lại trong cơ chất và hàm lượng cồn sinh ra.
a/Mục đích:
Xác định mật độ tế bào nấm men, hàm lượng tinh bột còn lại trong cơ chất và hàm lượng cồn sinh ra.
b/Cách tiến hành thí nghiệm:
Hàm ẩm của bắp trước khi gieo men là 77,4%.
Lượng giống sử dụng là 17%, 20%, 23%, 26% được lên men ở nhiệt độ 28oC.
•Xác định pH:
Phương pháp xác định pH:
Sử dụng máy đo pH Tritino của phòng thí nghiệm. Tiến hành đo pH của dung dịch với 3 lần đo và lấy kết quả trung bình cộng của 3 kết quả để lấy pH chính xác nhất.
Hình : Máy đo pH Tiến hành:
Thí nghiệm được khảo sát trên bắp đã hấp (mẫu rắn) nên rất khó theo dõi pH theo từng giờ lên men. Do đó, ở đây chỉ tiến hành khảo sát sự thay đổi pH trong các mốc thời gian là: 0 giờ, 72 giờ (thời điểm sinh khối tăng nhiều), 120 giờ (thời điểm cồn sinh ra nhiều nhất), 168 giờ (thời điểm kết thúc quá trình lên men chính). Để có thể xác định pH vào thời điểm lúc bắt đầu lên men, tiến
hành nghiền mịn 10 gam bắp sau đó hút 10 ml nước cất cho vào cốc 100ml và trộn đều. Đo và ghi nhận giá trị pH của dịch cháo này ( sử dụng máy đo pH với mức độ tin cậy là 0,001 ).
•Xác định mật độ tế bào nấm men bằng phương pháp đếm tế bào [9]
Có nhiều phương pháp định lượng sự hiện diện của vi sinh vật, ví dụ như: đếm số lượng tế bào trực tiếp trên kính hiển vi, định lượng giá tiếp thông qua mức độ cản ánh sáng (độ đục), đếm số khuẩn lạc mọc trên một môi trường xác định, định lượng một cách thống kê phương pháp pha loãng tới hạn (phương pháp MPN)…
Phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu.
Cấu tạo buồng đếm hồng cầu:
Buồng đếm hồng cầu thường là một phiến kính dày 2 – 3mm có một vùng đĩa đếm nằm giữa phiến kính và được bao bọc bởi một rãnh, Đãi đếm thấp hơn bề mặt của phiến kính khoảng 1/10mm, có hình tròn vì thế khi được phủ lên bằng một lá kính thì độ sâu của đĩa đếm sẽ đồng đều nhau. Vùng đĩa đếm có diện tích 1mm2 và được chia thanh 25 ô vuông lớn có diện tích mỗi ô là 1/25 mm2 và 400 ô vuông nhỏ hơn, mỗi ô có diện tích 1/400mm2.
Cách tiến hành:
Pha loãng huyền phù tế bào vi sinh vật thành năm độ pha loãng liên tiếp là 101, 102, 103, 104, 105.
Lắc mạnh dịch huyền phù tế bào (đã pha loãng), dùng pippet để hút dịch huyền phù này.
Đậy buồng đếm bằng một phiến kính mỏng.
Nhẹ nhàng dung đầu pipipet (có một giọt huyền phù vi sinh vật), đặt vào cạnh buồng đếm (nơi tiếp giáp với phiến kính mỏng). Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn.
Di chuyển khung đếm để dịch huyền phù tràn đầy các khoang.
Đặt buồng kính lên kính hiển vi, sử dụng vật kính x10 để tìm buồng đếm.Sau đó, chuyển sang vật kính x40 để quan sát.
Điều chỉnh cường độ ánh sáng bằng cửa sập để có thể quan sát rõ ràng cả tế bào lẫn các đường kẻ. Chọn một ô trung tâm và bốn ô nằm ngoài bìa để đếm.
Bắt đầu đếm tế bào sau khi nhỏ giọt dịch từ 3 – 5 phút, và đếm luôn tế bào nằm trên hai đường kẻ kề nhau được chọn của từng ô.
•Xác định hàm lượng cồn sinh ra bằng phương pháp chưng cất:
Cơ sở khoa học của quá trình chưng cất cồn là: phân tách hỗn hợp chất lỏng có nhiệt độ sôi khác nhau (dẫn đến chúng có nhiệt độ bay hơi khác nhau). Ở điều kiện áp suất thường, nhiệt độ sôi của rượu là 78,30C và nước là 1000C. Khi tiến hành chưng cất, rượu sẽ bốc hơi sớm và nhanh hơn nước do vậy mà tách được rượu ra khỏi nước.
Tiến hành:
Lấy 50ml dịch bắp sau lên men và 1 tấm giấy lọc cho vào bình tam giác có dung tích 500ml. Chúng tôi sử dụng giấy lọc để bọt không trào lên, ảnh hưởng đến quá trình bay hơi của cồn. Tiến hành chưng cất với tốc độ đều cho đến hết cồn trong mẫu, thời gian khoảng 60 – 90 phút. Để cồn bay hơi ra nhanh không bị mất, ống sinh hàn phải được làm lạnh bằng nước đá và bình t h u cồn phải đậy kín tránh cồn bay hơi. Để nguội đến nhiệt độ 250C, đem cồn vừa thu được cân xác định khối lượng riêng giữa cồn với nước (d250C/250C).Tra bảng 01: Density of ethanol at various temperatures( kg/l hoặc g/cm3) ở Phụ lục ta được phần trăm thể tích của cồn.
•Xác định hàm lượng tinh bột còn lại trong cơ chất bằng phương pháp thủy phân tinh bột bằng HCl [2]:
Nguyên tắc: sau khi loại bỏ các tạp chất có trong mẫu vật, tinh bột được hòa tan trong HCl. Sau đó, tủa tinh bột bằng cồn 900C. Rửa tủa và sấy khô, đem cân để tính hàm lượng tinh bột trong mẫu vật.
Tiến hành:
Cân chính xác 2g bắp đã giã nát. Rửa hai lần với ete dầu hỏa, mỗi lần cho vào 25ml ete dầu hỏa, lắc 5 phút, ly tâm đổ bỏ dung môi ở phía trên(dung môi có thể bị vẫn đục). Đun ấm để dung môi còn lại trong ống bay hơi hết.
Tiếp tục rửa bã trong ống hai lần vớ NaCl 10%, mỗi lần cho vào 50ml dung dịch NaCl 10%, lắc trong 15 phút, ly tâm đổ bỏ dung môi bên trên (dung môi có thể bị vẩn đục).
Rửa cùng cách như trên them hai lần nữa – một lần với cồn 700 và một lần vớ nước, mỗi lần lắc 1 – 2 phút. Làm ấm vài phút để bay hơi hết nước, để nguội.
Lấy hết bã tinh bột cho vào cốc thủy tinh, thêm 11ml nước cất và 14 ml HCl đậm đặc. Khuấy kỹ để tinh bột hòa tan trong dung dịch acid. Cho dung dịch tinh bột vào bình định mức 100ml, tráng rửa cốc thủy tinh và đổ vào bình. Làm đầy đến vạch mức. Lọc nếu có cặn.
Lấy 50ml dung dịch tinh bột cho vào cốc thủy tinh 250ml, thêm vào 110ml cồn 960. Khuấy đều để yên khoảng 1 giờ để tinh bột kết tủa hết. Đem ly tâm.Rửa tinh bột hai lần, một lần với 25ml cồn 700 và một lần với 25ml cồn 960. Cho tủa tinh bột vào một đĩa peptri đã rửa sạch, sấy khô và cân trọng lượng trước. Sấy ở 1300C trong một giờ. Để nguội trong bình hút ẩm và cân.
Công thức tính hàm lượng tinh bột còn lại trong cơ chất: Khối lượng tinh bột cân được có trong 100g mẫu vật.
c/Sơ đồ bố trí thí nghiệm Nước thải Lõi bắp Nước Bắp Hấp To= 100oO,t = 1 giờ Làm nguội ToC=28oC Rửa sạch Bào mỏng Lọc Gieo men Lên men Men(17%, 20%,23%,26%) Bã bắp Rượu bắp Hãm cồn Rượu gạo
d/Chỉ tiêu theo dõi
Ở từng tỉ lệ phối giống và thời gian lên men, tiến hành theo dõi pH, mật độ tế bào đếm được, hàm lượng cồn sinh ra và hàm lượng tinh bột còn lại trong cơ chất.