Giống vi khuẩn được phân lập từ chế phẩm vi sinh do viện Thuỷ Sản II cung cấp.
Môi trƣờng nhân giống và lên men Nitrosomonas sp.
(NH4)2SO4 3 g/l K2HPO4 0,5 g/l MgSO4 0,05 g/l CaCl2 0,04 g/l Phenol red 0,05 mg/l FeSO4 0,05 mg/l CaCO3 1 g/l
47
Nước cất đủ 1 lít
Khử trùng 1210C trong 20 phút
Môi trƣờng nhân giống và lên men Nitrobacter sp.
NaCl 0,3 g/l
KNO2 hoặc NaNO2 0,5 g/l
KH2PO4 0,25 g/l
MgSO4 1,4 g/l
CaCO3 1 g/l
Nước cất đủ 1 lít
Khử trùng 1210C trong 20 phút
Trong cả 2 trường hợp, khi làm môi trường thạch nghiêng thì agar thêm vào khoảng 20g/L.
Hình 49. (A) Dịch giống Nitrobacter sp., (B) Dịch giống Nitrosomonas sp.
Hình 50. Hình thái tế bào Nitrobacter (bên trái) và Nitrosomonas (bên phải) dưới kính hiển vi.
3.4Phƣơng pháp xác định ammonia, nitrite và nitrate
48 3.4.1 Xác định hàm lƣợng ammonia NH3 theo TCVN 2662-78 và 4563-88
Tiêu chuẩn quy định phương pháp so màu với thuốc thử Nessler để xác định hàm lượng nitơ dưới dạng ammonia. NH3 sẽ tác dụng với thuốc thử cho màu từ vàng đến nâu sẫm trong môi trường kiềm. Phương pháp này cho phép xác định hàm lượng ammonia từ 0,01- 5mg trong 1 lít nước. Khi nồng độ ammonia lớn hơn giới hạn trên, phải pha loãng mẫu trước khi xác định.
Nguyên tắc:
2(2KIHgI2) + NH3 + 3KOH (NH2)Hg-O-HgI + 7KI + 2H2O
(NH2)Hg-O-HgI là phức chất màu vàng, có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 430nm. Có thể xác định ammonia. Có thể xác định ammonia trực tiếp trong mẫu nước hoặc xác định sau khi đã cất mẫu. Khi nước bị bẩn, có màu… thì thường được cất trước khi xác định.
Chất gây nhiễu:
+ Một số hợp chất amine mạch thẳng, hợp chất cloramine hữu cơ mạch vòng, acetone, aldehyde, rượu… có thể phản ứng với thuốc thử Nessler cho phức chất màu vàng, gây sai số kết quả đo.
+ Ion sulfur gây kết tủa với Nessler nên cần loại bỏ bằng carbonate chì. Để kiểm tra ion sulfur ta sẽ cho vào mẫu nước một lượng nhỏ acid sulfuric (cứ 5ml thì cho 2ml acid, tỉ lệ 1:3). Sau khi cho acid, mẫu nước bị đục là có sulfur. Trường hợp đó phải cho vào 100ml mẫu thử 10 giọt kẽm acetate 25%. Khi kết tủa lắng xuống, lấy phần nước trong để xác định.
+ Xác định ammonia trong phòng riêng, để tránh ammonia có trong không khí xâm nhập vào làm sai kết quả thử và loại ion Ca2+, Mg2+ thì ta sẽ thâm dung dịch muối Raynhet.
Hoá chất
o Dung dịch ammonium NH4+ chuẩn: hoà tan 0,297g NH4Cl vào một lượng nước nhỏ sau đó thêm nước đến 100ml, lắc đều. Ta sẽ có dung dịch nồng độ 0,1mg NH4+/ml. Pha loãng dung dịch trên 10 lần để đạt nồng độ 0,01 mg NH4+/ml.
o Nước cất không chứa ammonia: acid hoá nước cất bằng HCl xuống pH khoảng 3-4. Sau đó thêm Na2CO3 tỉ lệ 12,5g : 1 lít nước cất. Đun sôi đến một từ lượng nước ban đầu.
o Thuốc thử Nessler: nghiền 10g thuỷ ngân iodur (mercuric iodide) HgI2 trong cối sứ với một lượng nhỏ nước cất, chuyển vào bình, thêm 5g KOH, hoà tan vào khoảng 50ml nước cất, trộn đều, thêm nước cất đến đủ 100ml. Để lắng dung dịch trong 3 ngày, trong chai màu sẫm và có nút kín. Sử dụng phần nước trong.
o Dung dịch muối Raynhet (natri kali tartrate): cân 30g muối natri kali tatrate đã được sấy khô ở 80-900
C trong 4-5 giờ (để loại hợp chất có NH4+). Hoà tan lượng cân vào 70ml nước cất không chứa ammonia và lọc qua giấy lọc đã rửa
49
sạch. Thêm 5ml thuốc thử Nessler để loại hết NH4+. Đựng dung dịch trong chai thuỷ tinh tối màu.
Thang chuẩn
Ống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Dung dịch chuẩn NH4+
0,01mg/ml 0 0,1 0,25 0,5 1 2,5 5 10 25 50
Nước cất không có ammonia
(ml) 50 49,9 49,75 49,5 49 47,5 45 40 25 0
Dung dịch muối Raynhet
(ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Thuốc thử Nessler (giọt) 1÷2 1÷2 1÷2 1÷2 1÷2 1÷2 1÷2 1÷2 1÷2 1÷2
NH3 (mg/L) 0 0,2 0,5 1 2 5 10 20 50 100
50
Xác định mẫu
Cho vào ống nghiệm 50ml nước cần kiểm nghiệm, thêm 0,2ml dung dịch muối Raynhet và 0,5ml thuốc thử Nessler, lắc đều. Sau 4-5 phút, đem ống nghiệm so màu với thang màu tiêu chuẩn. Nếu màu của mẫu thử đậm hơn màu các ống trong thang màu tiêu chuẩn, như vậy phải pha loãng mẫu thử bằng nước cất trước khi đo OD ở λ = 430nm.
3.4.2 Xác định hàm lƣợng nitrite NO2- theo TCVN 2658-78 và 4561-88
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp so màu với thuốc thử Gris để xác định hàm lượng nitrite từ 0,01÷1,0mg/l.
Nguyên tắc: ở pH từ 2-2,5 ion nitrite sẽ tạo sự kết hợp giữa acid sunfanilic với α- naphtylamin cho màu hồng đỏ. Đem so màu ở bước sóng 520nm của dung dịch mẫu thử với màu của thang chuẩn sẽ xác định được hàm lượng ion nitrite.
Các phản ứng xảy ra như sau: + Đầu tiên, NO2-
sẽ phản ứng với acid sunfanilic tạo thành muối diazo:
+ Sau đó muối này phản ứng với α-naphtylamin tạo thành hợp chất azo có màu hồng:
Chất gây nhiễu:
+ Clo hoạt động có thể cho màu phụ, trường hợp đó phải cho thuốc thử α-naphtylamin trước, sau đó cho acid sunfanilic. Ion đồng Cu2+
phân huỷ muối diazo nên cản trở phép xác định.
+ Sự tồn tại của một số ion: Fe3+, Pb2+, Hg2+, Ag+… tạo kết tủa cũng làm ảnh hưởng đến kết quả.
+ Để đảm bảo độ chính xác cao, cần lọc loại tạp chất trước khi so màu. Nếu mẫu có chất keo, thì cần dùng Al(OH)3 để làm trong.
51
+ Dung dịch nitrite NO2- chuẩn: cân chính xác 0,1468g NaNO2, thêm nước cất 2 lần vào đến 100ml. Lúc này, 1ml dung dịch sẽ tương ứng với 1mg HNO2. Pha loãng dung dịch 100 lần sẽ thu được dung dịch có nồng độ 0,01mg HNO2/ml.
+ Thuốc thử Gis A: lấy 0,50g acid sunfanilic hoà vào 150ml acid acetic 10%, khuấy đều và để yên.
+ Thuốc thử Gris B: lấy 0,10g α-naphtylamin hoà tan vào 20ml nước cất, khuấy đều. Đun sôi phần dung dịch thu được, để lắng trong, gạn lấy phần trong, bỏ cặn, thêm vào phần dung dịch trong 150ml acid acetic 10%, lắc đều.
Thang chuẩn dùng thang màu không bền, đo bằng máy OD: lấy 10 ống nghiệm so màu Nessler cùng loại sắp theo thứ tự từ 1 đến 10. Tiến hành pha hoá chất như sau.
Ống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Dung dịch NaNO2 (ml) 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5
Nước cất hai lần (ml) 49,5 49 48,5 48 47,5 47 46,5 46 45,5 45
Dung dịch thuốc thử Gris A 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Dung dịch thuốc thử Gris B 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
NO2- (mg/L) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
52
Xác định mẫu: cho vào ống nghiệm so màu Nessler 50ml mẫu cần thử, thêm 1ml thuốc thử Gris A và 1ml thuốc thử Gris B, lắc đều. Để yên 10ph, đem đo OD ở λ = 520 nm.
3.4.3 Xác định hàm lƣợng nitrite NO3- theo TCVN 4562-88
Tiêu chuẩn này qui định phương pháp so màu nhằm xác định NO3- trong khoảng từ 0,1-20mg/l, cụ thể khi cho NO3- tác dụng với natri salixylate sẽ tạo acid nitrosalixylic có màu vàng.
Nguyên tắc:
Acid nitrosalixylic có cực đại hấp thu ở bước sóng 410nm. Chất gây nhiễu:
+ Khi nồng độ ion Cl- đến 10mg/l sẽ cản trở phép xác định, cần dùng natri arsen hoặc có thể dùng Ag2SO4 để loại.
+ Ngăn ngừa sự chuyển hoá từ nitrite qua nitrate bằng acid sulfanilic.
+ Các tác nhân oxi hoá mạnh và các chất khử trong mẫu đều ảnh hưởng đến kết quả. Hoá chất:
+ Natri salixylate 0,5%: hoà tan 0,5g trong 50ml nước cất, định mức đến 100ml, sử dụng trong ngày.
+ NaOH 10N: hoà tan 400g NaOH trong 500ml nước cất, để nguội, cho vào bình định mức 1000ml, thêm nước đủ.
+ KNO3 chuẩn: hoà tan 0,1629g KNO3 trong một ít nước cất, định mức đến 100ml, ta sẽ được dung dịch có nồng độ 1 mg NO3- /ml, gọi là dung dịch làm việc.
Thang chuẩn
Ống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Dung dịch làm việc (ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Natri salixylate (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Đun cách thuỷ, để nguội
H2SO4 đậm đặc 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Để yên 10 phút, sau đó thêm một ít nước cất
NaOH 10N (ml) 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7
53
Hình 53. Đường chuẩn NO3-
Xác định mẫu: cho 10ml mẫu + 1ml natri salixylate vào bát sứ, sau đó đun cách thuỷ đến khô cạn, để nguội. Thêm 1ml H2SO4 đậm đặc để yên trong 10ph. Pha loãng cặn với nước cất, sau đó cho 7ml NaOH 10N rồi thêm nước cất định mức đến 50ml. So màu ở bước sóng 410nm. Thao tác trên cần thực hiện trong tủ hút để đảm bảo an toàn.
3.5Kết quả bƣớc đầu
3.5.1 Cố định vi khuẩn lên BC
Sau khi có được các miếng BC được cắt theo kích thước 2 x 2 cm và tiệt trùng, ta sẽ tiến hành bẫy-hấp phụ vi khuẩn lên chất mang. Thời gian bẫy bằng biện pháp lắc 200 rpm là 30 phút, sau đó mẫu ở nhiệt độ phòng theo từng chế độ hấp phụ khảo sát là 24, 48, 72 giờ.
Lượng vi khuẩn dùng cố định lên chất mang là 75 ml dịch giống Nitrosomonas và 75 ml dịch giống Nitrobacter cho vào erlen 500 ml có chứa 50 g BC (tỉ lệ BC trên dịch vi khuẩn là 1:3). Mật độ dịch vi khuẩn ban đầu được xác định bằng phương pháp trãi đĩa.
54
Hình 54. BC sau khi xử lý và hấp tiệt trùng, ở pH trung tính được sử dụng làm chất mang
Hình 55. Chế phẩm BC thu được sau 24, 48, 72 giờ cố định.
3.5.2 Thử nghiệm chế phẩm
Sau khi thu được chế phẩm BC, chúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm để xác định khả năng chuyển hoá NH3 và NO2 của vi khuẩn. Sử dụng 4 erlen loại 2 L, mỗi erlen chứa 800 ml nước biển đã được vô trùng. Sau đó cho vào 3 erlen lần lượt 80 g chế phẩm BC ứng với mỗi chế độ cố định (tỉ lệ BC trên lượng nước xử lý là 1:10), erlen thứ 4 làm mẫu đối chứng. Sau 1 tuần xử lý, đây là thời gian vi khuẩn thích nghi với môi trường mới, các thông số như hàm lượng NH3, NO2-
, NO3- được xác định bằng TCVN như đã nêu ở trên. Thời gian theo dõi là trong 3 tuần tiếp theo, lấy mẫu định kì 48 giờ.
Hình 56. Chế phẩm BC ở các chế độ bẫy-hấp phụ khác nhau được đem thử nghiệm trên nước biển
55
Sau một tuần xử lý, 10 ml mẫu được lấy ra từ mỗi erlen và đem xác định hàm lượng NH3 (mg/L) còn lại, kết quả như sau:
Sau 7 ngày OD mg NH3/L Đối chứng 0,194 27,071
24h 0,187 26,071 48h 0,076 10,214 72h 0,134 18,429
Như vậy có thể kết luận sơ bộ rằng chế phẩm vi khuẩn cố định lên BC có hoạt lực phân giải NH3, và chế độ 48 giờ là thời gian bẫy-hấp phụ cho khả năng xử lý cao nhất. Cần lưu ý là
Nitrosomonas ngoài khả năng oxi hoá NH3 thành
nitrite thì trong điều kiện thiếu oxi, nó sẽ oxi hoá NH3 lên các hợp chất như NO, N2O và thậm chí khử NO2- về các hợp chất NO và N2O để thu năng lượng. Do đó tuy khả năng chỉ sử dụng một nguồn cơ chất là NH3, nhưng do linh hoạt trong việc thu năng lượng trong cơ chế sinh hoá, do đó lượng NH3 mà vi khuẩn tiêu thụ sẽ không nhiều.
3.5.2.2 Nồng độ NO2- (mg/L)
Sau một tuần xử lý, 10 ml mẫu được lấy ra từ mỗi erlen và đem xác định hàm lượng NO2- (mg/L) còn lại, kết quả như sau:
Sau 7 ngày OD mg NO2-/L Đối chứng 1,050 1,360
24h 0,016 0,086 48h 0,009 0,078 72h 0,022 0,094
Như vậy có thể kết luận sơ bộ rằng chế phẩm vi khuẩn cố định lên BC có hoạt lực phân giải NO2- rất mạnh , và chế độ 48 giờ là thời gian bẫy-hấp phụ cho khả năng xử lý cao nhất. Cần lưu ý là Nitrosomonas sử dụng NH3 để tạo ra NO2- bên cạnh lượng NO2- có sẵn trong môi trường, và
Nitrobacter thì sử dụng NO2- mạnh đến mức các giá trị thu được rất thấp. Sơ bộ có thể đánh giá vi khuẩn Nitrobacter được sử dụng có hoạt lực nitrate hoá cao.
56
Sau một tuần xử lý, 10 ml mẫu được lấy ra từ mỗi erlen và đem xác định hàm lượng NO3- (mg/L) còn lại, kết quả như sau:
Sau 7 ngày OD mg NO3- /L Đối chứng (x10) 0,334 79,878
24h 0,616 8,184 48h (x10) 0,171 36,974 72h (x10) 0,227 51,711
Như vậy có thể kết luận sơ bộ rằng chế phẩm vi khuẩn cố định lên BC có hoạt lực phân giải NO2- tạo ra NO3-, và chế độ 72 giờ là thời gian bẫy-hấp phụ cho khả năng xử lý cao nhất. Cần lưu ý là vi khuẩn
Nitrobacter ngoài khả năng oxi hoá nitrite lên nitrate để thu năng lượng, nó sẽ không thải trực tiếp nitrate ra môi trường mà còn sử dụng để đồng hoá tạo nên các acid amin trong tế bào, và trong nhiều trường hợp, nếu thiếu cơ chất nitrite thì Nitrobacter sẽ khử nitrate về các hợp chất nitơ khác để thu năng lượng, vì thế lượng nitrate đo được chưa phản ánh hết con đường chuyển hoá nitrate trong vi khuẩn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1].Châu, Đ. N., Nghiên cứu thu nhận cellulose vi khuẩn làm chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật. Đại học Bách Khoa TPHCM: 2008;
[2].Phẩm, L. Đ.; Nhung, Đ. T. K.; Vân, T. C., Cơ sở khoa học trong Công nghệ bảo vệ môi trường - tập 2 - Cơ sở vi sinh trong Công nghệ bảo vệ môi trường. NXB Giáo Dục: Hà Nội, 2009;
[3].Bothe, H.; Ferguson, S. J.; Newton, W. E., Biology of the Nitrogen Cycle. 2007; p 453 [4].Brenner, D. J.; Krieg, N. R.; Staley, J. T.; Garrity, G. M., Bergey's Manual of Systematic Bacteriology-Part C. 2 ed.; Springer: 2005; Vol. The Proteobacteria, p 1414
[5].Chawla, P. R.; Bajaj, I. B.; Survase, S. A.; Singhal, R. S., Microbial Cellulose: Fermentative Production and Applications. Food technology and biotechnology 2009, 47 (2), 107–124
[6].Colliver, B. B.; Stephenson, T., Production of nitrogen oxide and dinitrogen oxide by autotrophic nitrifiers. Biotechnology Advances 2000, 219-232
[7].Dworkin, M.; Falkow, S.; Rosenberg, E.; Schleifer, K.-H.; Stackebrandt, E.,
Proteobacteria: Alpha and Beta Subclasses. 2 ed.; Springer: 2006; Vol. 5, p 964
[8].Dworkin, M.; Falkow, S.; Rosenberg, E.; Schleifer, K.-H.; Stackebrandt, E.,
Ecophysiology and Biochemistry. 2 ed.; Springer: 2006; Vol. 2, p 1156
[9].Hagopian, D. S.; Riley, J. G., A closer look at the bacteriology of nitrification.
Aquacultural Engineering 1998, 223-244
[10].Manju, N. J.; Deepesh, V.; Achuthan, C.; Rosamma, P.; Singh, I. S. B., Immobilization of nitrifying bacterial consortia on wood particles for bioaugmenting nitrification in shrimp culture systems. Aquaculture 2009, 294, 65-75
[11].Prescoot, L. M., Microbiology. 5 ed.; McGraw−Hill: New York, 2002; p 1147
[12].Sato, C.; Schnoor, J. L.; McDonald, D. B.; Huey, J., Test medium for the growth of
Nitrosomonas europaea. Applied and Environmental Microbiology 1985, 1101-1107
[13].Shan, H.; Obbard, J. P., Ammonia removal from prawn aquaculture water using immobilized nitrifying bacteria. Applied Microbiology and Biotechnology 2001, (57), 791- 798
[14].Skinner, F. A.; Walker, N., Growth of Nitrosomonas europaea in batch and continuous culture. Microbiology 1961, 38, 339-349
[15].Sorokin, D. Y.; Muyzer, G.; Brinkhoff, T.; Kuenen, J. G.; Jetten, M. S. M., Isolation and characterization of a novel facultatively alkaliphilic Nitrobacter species, N. alkalicus sp. nov.
Archives of Microbiology 1988, (170), 345–352
[16].Wallace, W.; Nicholas, D. J. D., The biochemistry of nitrifying microorganisms.
Biotechnology Review 1969, 44, 359-391
[17].Biofiltration for aquaculture. http://www.biofilters.com/webfilt.htm [18].Carboxysome. http://en.wikipedia.org/wiki/Carboxysome