3.1.1. Vật liệu
Các chủng Flavobacterium aurantiacum và Rhizopus delemar do phòng vi sinh Viện cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch cung cấp
3.1.2. Các hóa chất dùng cho phân tích độc tố aflatoxin B1
* Na2SO4 khan ( Trung Quốc ). * NaCl nhà máy hóa chất Việt Trì.
* Các dung môi cloroform, hexan, aceton, chì axetat (Trung Quốc). * Các chuẩn độc tố aflatoxin B1 (Sigma, Mỹ).
* Silicagel 60 F245, Merck, Cộng hòa liên bang Đức, cho sắc ký lớp mỏng.
3.1.3. Dụng cụ thí nghiệm
* Buồng sắc lý lớp mỏng (chromatography tank ), Thụy Sỹ. * Máy nghiền đồng thể polytron, Cộng hòa liên bang Đức. * Giấy lọc Whatman No1, Chemapoli, Tiệp Khắc.
* Kính hiển vi Olympus có gắn máy chụp ảnh Nhật. * Phễu chiết.
* Ống hút tự động 0,2ml và 0,1ml Trung Quốc. * Bơm tiêm vi lượng Hamilton.
* Máy cô chân không.
* Đèn cực tím 254 nm – 366nm Camag (Thụy Sỹ ). * Máy đánh sóng siêu âm.
* Các dụng cụ dùng cho nuôi cấy vi sinh vật. * Máy cất quay chân không ( Đức).
* Nồi hấp tự động ( Đài Loan). * Máy lắc.
3.2. Phương pháp chiết xuất aflatoxin.
Chúng tôi tiến hành phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc kí bản mỏng do Doronina và Maksimenko [17] mô tả. Dựa trên cơ sở của phương pháp CB (AOAC) [13] có cải tiến gồm những giai đoạn sau:
25 gam mẫu được nuôi A. flavus, chiết xuất aflatoxin bằng hỗn hợp aceton (100ml) và dung dịch NaCl 10% (25ml). Mẫu được nghiền trên máy nghiền đồng thể Polytron. Lọc qua giấy lọc Whatman No1. Lấy 50ml dịch lọc và kết tủa bằng Pb(CH3COO)2 10% (50ml) để loại bỏ protein, tiếp tục lọc qua giấy lọc để thu 80ml dịch lọc. 80 ml dịch lọc đó chuyển vào phễu chiết và được bổ sung 2 lần hexan (40ml ) để chiết xuất bằng hai pha lỏng-lỏng. Bỏ phần dịch nổi phía trên. Phần dịch trong ở phía dưới lại tiếp tục đưa trở lại phễu chiết và được bổ sung cloroform 40ml (3lần). Lớp nước aceton nhẹ hơn sẽ nổi lên trên, loại bỏ lớp aceton. Lớp clorofrom có aflatoxin được giữ lại. Làm bay hơi toàn bộ lượng clorofrom có aflatoxin ở máy cất quay cô chân không. Phần cặn được hòa tan vào 100 µl clorofrom, giữ ở 40C cho đến khi tiến hành định lượng và định tính aflatoxin.
Quy trình chiết tách Aflatoxin
Nghiền 5 phút trên máy nghiền đồng thể Nghiền 5 phút trên máy
nghiền đồng thể
Lọc lấy 50 ml dịch Lọc lấy 50 ml dịch
Lấy pha trên cho vào Bình cầu
Lấy pha trên cho vào Bình cầu Lấy phần dịch trong Lấy phần dịch trong Phiễu chiết Phiễu chiết Chloroform (Nhắc lại 3 lần) Chloroform (Nhắc lại 3 lần) Lọc 80 ml dịch Lọc 80 ml dịch
Cất quay (cô chân không) lấy 3 ml cặn
Cất quay (cô chân không) lấy 3 ml cặn Ống nhót để bay hơi lấy cặn Ống nhót để bay hơi lấy cặn Bọc giấy bạc bảo quản lạnh 4oC Bọc giấy bạc bảo quản lạnh 4oC 40 ml n-hexan (nhắc lại 2 lần) 40 ml n-hexan (nhắc lại 2 lần) Bỏ phần dịch nổi trên Bỏ phần dịch nổi trên 50 ml chì axetat 10% 50 ml chì axetat 10% Na2SO4 khan Na2SO4 khan 25ml NaCl 10% 100ml aceton 25ml NaCl 10% 100ml aceton
- Định tính aflatoxin:
Dùng bơm tiêm vi lượng (mycrosyring) nhỏ trên sắc lý lớp mỏng 2µl, 4µl, 6µl và 2lần 10µl mẫu phân tích. Một lượng nhỏ của dung dịch được chấm vào phiến mỏng cách đường thẳng mép dưới 2cm và 1,5-2 cm từ mỗi cạnh bên.Việc chấm phải thực hiện ở những phần nhỏ sao cho đường kính của các vết nhỏ không quá 5mm trên đường bắt đầu. Nhỏ 2, 4, 6 µl chuẩn aflatoxin B1
với nồng độ 0,71 ng/µl trên cùng một phiến bản mỏng. Nhỏ 5 µl chuẩn aflatoxin B1 vào cùng một vết của mẫu phân tích (10µl) như chuẩn trong. Hệ dung môi cho sắc ký bản mỏng một chiều là: clorofrom : aceton = 1: 9.
Giới hạn độ phát hiện của phương pháp là 1µg aflatoxin/kg sản phẩm, hệ số dao động là 0,3-5,0. Phát hiện aflatoxin bằng cách phát hiện sự phát quang của phiến lớp mỏng ở buồng tối dưới đèn cực tím sóng dài (có bước sóng 365 nm). Phát hiện bằng mắt thường trên sắc ký đồ của mẫu chiết, cường độ phát quang của các vết có giá trị Rf bằng với chuẩn. Chọn phần tương ứng thích hợp của mẫu phân tích cho việc định lượng aflatoxin.
Thử xác minh aflatoxin: * Thử với acid vô cơ: phun lên bản mỏng dung dịch acid H2SO4 trong nước tỉ lệ 2: 1. Nếu như màu phát quang các vết của mẫu chiết không chuyển sang màu vàng như ở mẫu chuẩn, tức là không có
aflatoxin trong mẫu thử. Nhưng nếu màu phát quang của các vết của mẫu thử aflatoxin ứng với nồng độ di động sắc ký cũng chuyển thành màu vàng, điều đó có thể xem như có aflatoxin trong mẫu thử.
* Thử với acid trifluoroaxetic: Chỉ áp dụng aflatoxin B1, G1, M1 : sau khi nhỏ các vết của các mẫu thử và chuẩn aflatoxin, nhỏ lên các vết chấm của chuẩn và mẫu thử 30 µl acid trifluoroaxetic. Để phản ứng xảy ra trong 10 phút. Tránh ánh sáng. Sau đó chạy sắc ký trên hệ dung môi thích hợp. Aflatoxin sau khi kết họp với axit trifluoroaxetic tạo thành một hợp chất phân cực hơn nên có Rf thấp hơn so với aflatoxin không có axit chỉ thị. Mẫu có aflatoxin sẽ tụt ngang với Rf của chuẩn so với chuẩn không chấm axit trifluoroaxetic. Đây là phản ứng chính thức được dùng để làm phản ứng thử xác minh aflatoxin của các phòng thí nghiệm trên thế giới.
_Định lượng aflatoxin:
Nhỏ 10µl chất chiết với đường kính của vết không quá 5mm, ở góc dưới bên phải của bản mỏng và cách mép 1,5cm.
Ở góc dưới bên trái cách mép 1, 2, 3 cm và 1,5 cm từ mép dưới của bản mỏng nhỏ 2, 4, 6 µl theo thứ tự dung dịch chuẩn aflatoxin.
Thực hiện sắc kí bản mỏng ở hệ dung môi cloroform : aceton =9 : 1. So sánh cường độ phát quang của các chuẩn aflatoxin khác nhau trên phiến mỏng với vết của mẫu thử.
Bằng mắt thường định lượng aflatoxin ở vết của mẫu thử (nanogram) theo công thức sau:
V1 .V3 .V5 . m
C = ——————
V2 . V4 . V6 . M Trong đó:
C là nồng độ aflatoxin B1 ở mẫu thực phẩm phân tích ng/g (ppb) V1 là thể tích hỗn hợp nước – aceton (ml)
V2 là thể tích hỗn hợp nước – aceton lấy cho phân tích (ml) V3 là thể tích hỗn hợp nước – aceton và chì acetate (ml) V4 là thể tích dịch lọc sau khi làm sạch bằng chì acetate (ml)
V5 là thể tích dịch chiết đã bay hơi làm sạch ở cloroform trước khi làm sắc kí bản mỏng (µl)
V6 là thể tích dung dịch chiết chấm vào bản mỏng (µl) m là lượng aflatoxin ở vết chuẩn trên phiến mỏng (ng) M là trọng lượng sản phẩm lấy để phân tích (g)
3.2.7. Phương pháp xác định hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao bằng chủng Rhizopus. delemar mức độ cao bằng chủng Rhizopus. delemar
Bổ sung 1 lượng Rhizopus delemar với mật độ bào tử là 106 / g xử lý vào 250 g ngô hạt hoặc lạc hạt có bổ sung các chất khoáng và 1 lượng aflatoxin là 200 ppb. Tiến hành nuôi các chủng Rhizopus delemar trên ngô hạt hoặc lạc hạt ở các nhiệt độ là 200C, 250C, 280C, 300C, 350C và độ ẩm là 15%, 17%, 20%, 25%, 30%. Sau các khoảng thời gian là từ 1 đến 9 ngày xác định hiệu quả khử nhiễm aflatoxin bằng chủng Rhizopus delemar trên thông qua việc xác định hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô xử lý. Chúng tôi tiến hành theo phương pháp của Nguyễn Thuỳ Châu.
3.2.8. Phương pháp xác định hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao bằng chủng Flavobacterium aurantiacum. mức độ cao bằng chủng Flavobacterium aurantiacum.
Bổ sung 1 lượng hỗn dịch tế bào Flavobacterium aurantiacum sao cho có nồng độ là 106 tế bào/ml môi trường bột ngô lỏng hoặc bột lạc lỏng có bổ sung một số chất khoáng và một lượng aflatoxin là 200ppb. Tiến hành nuôi cấy Flavobacterium aurantiacum trên môi trường bột ngô lỏng hoạc bột lạc lỏng ở các nhiệt độ 220C, 240C, 260C,280C, 300C. Sau các khoảng thời gian từ 1 đến 9 ngày xác định hiệu quả khử nhiễm aflatoxin bằng Flavobacterium
aurantiacum thông qua việc xác định hàm lượng aflatoxin trong mẫu xử lý. Chúng tôi tiến hành theo phương pháp của Nguyễn Thuỳ Châu.