5.4.2.Tinh dầu tràm [6], [7], [13], [20]
Ở Việt Nam tinh dầu tràm chủ yếu được chiết xuất từ lá của cây tràm gió (Meulaleuca leucadendron var. miromelaleucetum) và cây tràm cừ (Meulaleuca leucadendron var. macromelateucetum).
Tinh dầu tràm có dạng lỏng trong suốt, không màu hay màu lục nhạt, mùi thơm đặc trưng. Tinh dầu không tan trong nước, tan trong ethanol, aceton, ether, CHCl3, dầu thực vật…
Thành phần hóa học của tinh dầu tràm:
- Tinh dầu tràm gió: 1,8 cineol (30%), -terpinolen, -terpinen, trans- cariophilen, linalol…
- Tinh dầu tràm cừ: 1,8 cineol (2%), -terpinolen (10%), -terpinen (10%), β- malien (15%)…
Những nghiên cứu về tính kháng khuẩn của tinh dầu tràm cho thấy thành phần terpinen và linalol có tác dụng kháng khuẩn mạnh còn thành phần 1,8- cineol có tác dụng kháng nấm, chống co thắt.
linalol
Hình 1.9: Công thức cấu tạo một số nhóm chất trong tinh dầu tràm
Tinh dầu tràm là một chất sát khuẩn mạnh, có phổ kháng khuẩn rộng, có khả năng kháng:
- Vi khuẩn gram dương: Bacillus subtilis, Bacillus ceneus, Enterococcus feacalis, Corynebacterium spp, các chủng kháng Methicillin: Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus feacalis…
- Vi khuẩn gram âm: Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Shigella sonnei…
- Nấm: Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis.
- Virus: Herpes simplex.
Do có tính sát khuẩn mạnh nên tinh dầu tràm thường được dùng trong phẫu thuật làm chất sát khuẩn ngoài da, thuốc sát trùng đường hô hấp, thuốc tẩy uế, tẩy trùng…Tinh dầu tràm thường được dùng để chữa các vết thương có mủ, vết loét do có tính sát trùng và cầm máu, có tác dụng tăng tái tạo tế bào làm chóng lành sẹo.
5.4.3.Hợp chất chiết xuất từ rau má [6], [8], [23], [24], [25]
Madecassol là loại thuốc có tác động kích thích sự sinh tổng hợp collagen được điều chế từ dịch chiết lá rau má (Centella asiatica) . Có nhiều dạng sản phẩm là cao chiết đặc, dạng thuốc mỡ, thuốc bột, dạng viên nén. Thành phần chính của thuốc là asiaticoside, asiatic và madecassic acid là các saponin triterpenoid nhóm ursan có trong lá rau má. Các chất này có tác dụng tăng tổng hợp collagen, glycosaminoglycan, fibronectin (là các chất nền tảng của trung bì); kích thích sự hình thành lipid và protein cần thiết của da ; đẩy nhanh quá trình biểu mô hóa và hình thành mô hạt ; làm cho vết thương chóng lành. Madecassol và một số các sản phẩm chiết xuất từ rau má đã được ứng dụng rộng rãi làm thuốc chóng lành sẹo, làm liền các vết mổ, vết thương, chữa loét, bỏng mà không để lại sẹo.
Hình 1.10: Thành phần triterpenoid trong rau má
5.4.4.Nghệ [7], [9], [26]
Từ lâu nghệ (Curcuma longa L.) đã được biết đến là một thảo dược có tác động tốt trong việc hàn gắn các vết thương, vết loét, làm liền sẹo. Bộ phận sử dụng chính của cây nghệ là phần thân rễ chứa thành phần polyphenol là curcuminoid có tác dụng chống oxi hóa và kháng viêm mạnh. Tinh dầu nghệ chiếm khoảng 5 -15% có tác dụng kháng nấm, vi khuẩn, kí sinh trùng. Trong điều trị bỏng, sử dụng tinh dầu nghệ ở giai đoạn sớm có tác dụng loại bỏ hoại tử bỏng, trong giai đoạn muộn có tác dụng tăng sinh tái tạo biểu mô, chống tạo sẹo lồi.
5.5.5.Mỡ trăn [38]
Mỡ trăn đã được sử dụng để điều trị bỏng khá phổ biến trong dân gian. Thành phần các acid béo và vitamin A có trong mỡ trăn có tác dụng đẩy mạnh quá trình tạo biểu mô và tạo bề mặt đàn hồi cho da, làm nhanh lành vết thương
bỏng, vết loét, làm mềm và mịn da nhất là da khô khi trời lạnh. Mỡ trăn thường được sử dụng ở dạng kết hợp trong các sản phẩm làm đẹp da.
1.VẬT LIỆU
1.1.Đối tượng nghiên cứu
Màng sinh học gelatin- alginat được tẩm một số thuốc thiên nhiên thường dùng trong điều trị bỏng là hỗn hợp dầu mù u và tinh dầu tràm, dầu trị bỏng Trancumin, hỗn hợp của tinh dầu tràm và tinh chất rau má Madecassol®
1.2.Dụng cụ - Thiết bị
- Pipetman (100µl, 1000µl) - Đầu típ (100µl, 1000µl) - Pipet thủy tinh (10ml) - Quả bóp cao su - Becher (50ml, 100ml, 250ml, 1000ml) - Oáng đong (250ml, 500ml) - Bình định mức (1000ml) - Đũa khuấy - Cá khuấy từ - Ly thủy tinh - Giấy bạc - Giấy thấm
- Điã petri nhựa (5cmx1,2cm) - Hộp nhựa
- Điã petri thủy tinh (đường kính 9cm) - Que cấy vòng
- Que cấy gòn - Cuvet
- Oáng nghiệm - Đèn cồn
- Lọ nâu 5ml, 100ml - Chuồng nuôi chuột - Khay inox
- Dao lam - Dao mổ
- Kéo, kẹp cong, kẹp thẳng
- Thanh kim loại gây bỏng (1,6 cmx1,6 cm) - Gạc vô trùng
- Băng keo vải - Lọ nhựa đựng mẫu
- Cân phân tích (Mettler AEO)
- Máy khuấy từ gia nhiệt (KIA, Mỹ và OSA, Anh) - Máy lắc
- Máy vortex
- Máy đo mật độ quang (Gallenkamp, Nhật) - Nồi hấp khử trùng (Nhật)
- Tủ sấy
- Tủ cấy vô trùng - Tủ ấm 370C
- Tủ lạnh –20oC, tủ lạnh –80oC (Sannyo, Nhật)
1.3. Nguyên vật liệu – Hoá chất
- Chuột nhắt trắng Mus musculus var. Albino có trọng lượng 28- 30g/con, cùng lứa tuổi, thu nhận tại Khoa Dược lý - Viện Y học dân tộc TP.HCM.
- Các chủng vi khuẩn: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,
Escherichia coli từ Phòng Vi sinh và Sinh học phân tử, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên Tp. HCM.
- Gelatin (Merck, Đức): dạng bột mịn. - Alginat (Kanto, Nhật): dạng bột mịn.
-1-ethyl-(3-3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride – EDC (Sigma)
- Dầu mù u (được bào chế bởi Viện y dược học dân tộc TP.HCM)
- Dầu trị bỏng Trancumin: thành phần chính gồm mỡ trăn, nghệ, tinh dầu tràm (sản phẩm của công ty cổ phần dược phẩm OPC)
- Tinh dầu tràm
- Madecassol® (sản phẩm của DELPHARM, Pháp) - Tween 20 (Sigma)
- Aceton 99,5% (Trung Quốc) - Diethyl ether 99,5% (Trung Quốc) - Formol 10%
- NaCl 8,5 o/oo
- Dung dịch PBS (Dulbeccos Phosphate buffer saline): [10]
KCl 0.2g
KH2PO4 0.2g NaCl 8.0g Na2HPO4.12H2O 2.885g Nước cất 1000ml
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn NA (nutrient agar): [11] Cao thịt 3g Pepton 5g NaCl 5g Agar 20g Nước cất 1000ml - Cồn 96o, 70o - Nước cất 1 lần - Nước cất 2 lần.
2. PHƯƠNG PHÁP
2.1.Tạo màng gelatin- alginat [1]
- Pha dung dịch gelatin 1% và alginat 1% : cân và khuấy gelatin (ở 50oC), alginat (ở nhiệt độ phòng) với nước cất 2 lần trong 3 giờ.
- Trộn và khuấy dung dịch gelatin 1% và alginat 1% để thu được hỗn hợp gelatin: alginat (G:A) theo tỉ lệ (w/w) 8G:2A trong 30 phút.
- Rót 10g hỗn hợp dung dịch vào điã petri nhựa (5 cm x1,2 cm). - Để lạnh ở –70oC trong 40 giờ.
- Lắc chậm (100 vòng/phút) từng màng G:A trong 20ml hỗn hợp aceton: nước cất (tỷ lệ 9:1) có chứa 60mg EDC (0,3% EDC) trong 24 giờ.
- Lấy màng ra làm khô màng bằng giấy thấm sau đó để khô lạnh ở –70oC trong 24 giờ.
2.2.Khảo sát khả năng mang và thải thuốc của màng gelatin- alginat được ngâm với các hợp chất tự nhiên
Chuẩn bị 3 loại thuốc để ngâm màng
Hỗn hợp dầu mù u và tinh dầu tràm: Vì dầu mù u có tác dụng tái sinh mô tốt nhưng có khả năng kháng khuẩn hạn chế (tác động mạnh trên vi khuẩn gram dương và yếu trên vi khuẩn gram âm)[13] nên được phối hợp với tinh dầu tràm là một chất có tác dụng sát trùng mạnh có phổ kháng khuẩn rộng (tác động mạnh lên cả vi khuẩn gram dương, gram âm, nấm mốc và virus) [20] theo tỷ lệ 1:1 (v/v). Dầu mù u và tinh dầu tràm được sử dụng ở dạng nguyên chất.
Hỗn hợp tinh dầu tràm và hợp chất Madecassol chiết xuất từ rau má: Madecassol có tác dụng chính là kích thích sinh tổng hợp collagen, làm tăng khả năng tái sinh mô nhưng lại không có tính kháng khuẩn [13] nên được sử dụng kết hợp với tinh dầu tràm. Bột thuốc madecassol được pha trộn với tinh dầu tràm nguyên chất để được hỗn hợp tinh dầu chứa 1% madecassol.
Cả 3 loại thuốc đều được pha trộn với dung dịch Tween 20 với tỉ lệ 0,5% nhằm làm nhũ hóa tinh dầu có trong từng loại thuốc giúp cho khả năng đi vào bên trong cấu trúc màng của tinh dầu tốt hơn tránh được sự bám dính trên bề mặt màng dễ bị rửa trôi. Dung dịch tween 20 sử dụng với tỷ lệ 0,5% được chứng minh là không gây tác hại lên cơ thể và không làm ảnh hưởng đến tính kháng khuẩn của thuốc [13], {21], [22].
Màng ngâm thuốc
- Cắt màng đã được làm khô lạnh thành từng miếng có kích thước 1 cm x 1cm.
- Ngâm từng miếng màng trong 2ml dung dịch từng loại thuốc ở 370C trong 24 giờ.
- Màng sau khi ngâm thuốc được lấy ra và tiếp tục ngâm trong dung dịch PBS ở 370C theo các nghiệm thức N0, N1, N2, N3, N4 để thử nghiệm khả năng kháng khuẩn.
Với N0 : không ngâm trong PBS N1 : ngâm trong PBS 1 ngày
N2, N3, N4: ngâm trong PBS 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày (thay PBS mỗi ngày) - Cấy các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa,
Escherichia coli có mật độ 106 tế bào/ml (đo ở bước sóng 610 nm) lên các đĩa petri chứa môi trường NA.
- Đặt các miếng màng theo các nghiệm thức ngâm PBS lên các điã môi trường có vi khuẩn, ủ trong 24 giờ ở 370C.
- Đo đường kính vòng kháng khuẩn. - Lặp lại thí nghiệm 3 lần.
2.3.Bảo quản vô trùng màng gelatin- alginat
Màng gelatin- alginat sau khi làm khô lạnh được ngâm trong 5ml thuốc trong 24 giờ sau đó được đóng gói và chiếu tia gamma với liều 25 kGy bằng nguồn cobalt 60 tại Trung tâm công nghệ bức xạ thành phố Hồ Chí Minh. Đây là liều
phổ biến để diệt khuẩn, phù hợp với sự an toàn tuyệt đối [12] và giữ được hàm lượng các axit amin trong thành phần của màng ở mức chấp nhận được. Màng sau khi chiếu xạ được bảo quản ở 00C.
2.4.Kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của màng gelatin - alginat ngâm thuốc sau khi chiếu xạ
Màng gelatin- alginat ngâm thuốc sau khi được chiếu xạ và bảo quản sau khoảng thời gian 7 ngày được cắt thành từng miếng nhỏ (1 cm x1 cm) đặt trên điã thạch có vi khuẩn ủ ở 370C trong 24 giờ. Đo đường kính vòng kháng khuẩn.
2.5.Thử nghiệm màng gelatin- alginat ngâm thuốc trên chuột nhắt trắng được gây bỏng
- Chuột nhắt trắng Mus musculus var. Albino sau khi mua về được nuôi ổn định trong 1 tuần, bố trí mỗi con một chuồng với cùng điều kiện chăm sóc và ăn uống như nhau.
- Cạo lông một bên vùng từ vai đến lưng chuột.
- Chuột được gây mê bằng eter rồi gây bỏng nhiệt khô (độ 3, 4) bằng miếng kim loại nung nóng trên ngọn lửa đèn cồn trong 30 giây, thời gian gây bỏng là 3 giây tại vùng lưng chuột.
- Sau 2 ngày gây bỏng, cắt lọc hoại tử tại vùng gây bỏng. - Chia chuột thành 5 nhóm thí nghiệm (bảng 2.1)
- Chọn 3 mốc thời gian sau khi điều trị: 4 ngày (N4), 7 ngày (N7), 10 ngày (N10) để theo dõi tiến trình lành hóa vết thương bỏng.
- Ở mỗi mốc thời gian khảo sát, tiến hành: * Nhận xét dấu hiệu lâm sàng.
* Thu mẫu mô (gồm vùng mô tổn thương và vùng mô lành xung quanh), cố định trong formol 10%, đánh giá về mặt mô học tiến triển vết thương bỏng trong quá trình điều trị tại Khoa Giải phẫu bệnh - Bệnh viện Chợ Rẫy với các bước chính: cắt lọc khử nước cố định mẫu cắt mẫu nhuộm tiêu bản với hematoxylin và eosin dán lame quan sát và đánh giá kết quả.
Bảng 2.1: Các nhóm chuột thí nghiệm
STT Nhóm thí nghiệm Số lượng chuột (con)
Số lần lặp lại 1 Đối chứng (để tự nhiên, không điều trị) 3 2 2 Đắp gạc sulfadiazin bạc 3 2 3 Đắp màng GA ngâm hỗn hợp dầu mù u và dầu tràm (màng MU) 3 2 4 Đắp màng GA ngâm thuốc trị bỏng Trancumin (màng T) 3 2 5 Đắp màng GA ngâm hỗn hợp dầu tràm và madecassol (màng MT) 3 2 2.6. Xử lý số liệu
Số liệu thu nhận được xử lý bằng chương trình Excel, chương trình Statgraphic 7.0 (của Trường đai học Michigan – Mỹ) bao gồm: tính toán thống kê sai số chuẩn và độ khác biệt có ý nghĩa nhỏ nhất (Least Significant Different – LSD) ở mức xác xuất p = 95% bằng phương pháp phân tích phương sai (Analysis of Variance – ANOVA).
Hình 2.1: Gelatin dạng bột Hình 2.2: Alginat dạng bột
Hình 2.3: Tác nhân khâu mạch EDC Hình 2.4: Tinh dầu tràm
Hình 2.7: Chuột được nuôi riêng mỗi con một chuồng
Hình 2.8: Cạo lông chuột Hình 2.9: Hơ nóng thanh kim loại gây bỏng
Hình 2.10: Gây bỏng chuột Hình 2.11: Chuột được băng bó sau khi đắp màng
KẾT QUẢ
1.Tạo màng gelatin - alginat
Màng sinh học che phủ vết thương được tạo ra có thành phần gồm gelatin và alginat và một tác nhân tạo liên kết chéo khâu mạch là EDC. EDC hoạt động khâu mạch thông qua sự tạo thành liên kết amide giữa nhóm carboxyl và nhóm amin. Sự khâu mạch có thể xảy ra giữa alginat (nhóm carboxyl) với gelatin (nhóm amin) hay ngay trong cấu trúc của gelatin (mang cả nhóm carboxyl và nhóm amin) để tạo thành dẫn xuất urea hoà tan, tạo cấu trúc màng [1]
Từ những kết quả nghiên cứu trước [1], cho thấy màng gelatin – alginat (màng GA) được tạo ra với tỉ lệ thành phần gelatin : alginat là 8 :2 và nồng độ chất khâu mạch EDC là 0,3% (kí hiệu màng GA 82x3) cho kết quả thử nghiệm tốt nhất nên được chọn để khảo sát trong thí nghiệm này.
Màng GA 82x3 có một số đặc điểm sau:
Có cấu trúc lỗ xốp, đường kính lỗ từ 10-100 µm. Chức năng chủ yếu của cấu trúc lỗ xốp trong màng phủ vết thương là giúp hấp thu dịch mủ, dịch viêm tại vùng vết thương; giúp cho sự tăng sinh và di chuyển của tế bào, nguyên bào sợi; hấp thu và mang một số thuốc. Màng GA 82x3 có kích thước lỗ phù hợp cho sự hấp thu các thuốc trị bỏng ( do các thuốc này đều ở dạng tinh dầu và đã được làm nhũ tương hóa bằng tác nhân nhũ tương hóa là tween 20 tạo thành các hạt nhỏ có đường kính thay đổi từ 0,01-100 µm) [37], đặc biệt thuận lợi cho sự di chuyển của tế bào ở bên trong màng (đường kính tế bào biểu bì và nguyên bào sợi của da vào khoảng 10-13 µm).
Khả năng hấp thu nước tốt: 3,13 ± 0,86 g nước/g màng. Khả năng hấp thu nước của màng nhờ vào sự có mặt của các nhóm chức ưa nước như –OH, COOH, COONH2 trong thành phần của gelatin và alginat. Khả năng hấp thu nước là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá vật liệu phủ vết thương.
Hình 3.1: Màng gelatin – alginat
2.Đánh giá khả năng kháng khuẩn của màng gelatin - alginat được ngâm với các hợp chất tự nhiên
Khả năng kháng khuẩn của màng.gelatin- alginat ngâm thuốc được đánh giá thông qua đường kính vòng kháng khuẩn đo được theo các mốc thời gian. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1; bảng 3.2; bảng 3.3.
Bảng 3.1Khả năng kháng Pseudomonas aeruginosa của màng gelatin –
alginat ngâm với các loại thuốc ở các mốc thời gian
Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Màng GA ngâm thuốc N0 N1 N2 N3 N4 LSD (p=95%) Dầu mù u + dầu tràm (màng MU) 36.3 ±2.67 13.5 ±2.83 0.0 ±0.00 0.0 ±0.00 0.0 ±0.00 4.12 Dầu Trancumin (màng T) 27.2 ±6.17 0.0 ±0.00 0.0 ±0.00 0.0 ±0.00 0.0 ±0.00 Dầu tràm+ Madecassol (màng MT) 45.7 ±3.56 25.8 ±8.5 16.8 ±2.89 13.7 ±3.67 0.0 ±0.00 7.40 LSD (p =95%) 6.62 Từ bảng 3.1 có biểu đồ 3.1
Biểu đổ 3.1: Đường kính vòng kháng Pseudomonas aeruginosa của các màng gelatin – alginat ngâm các loại thuốc ở các mốc thời gian
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Đ ươ øng k ính vò ng kha ùng khua ån (m m ) N0 N1 N2 N3 N4 Ngày Màng MU Màng T Màng MT Từ bảng 3.1 và biểu đồ 3.1 có nhận xét:
- Khả năng kháng Pseudomonas aeruginosa của từng màng GA ngâm thuốc là khác nhau ở mỗi ngày:
+ Màng MU: kháng tốt ở ngày 0, khả năng kháng giảm rõ sau 1 ngày ngâm trong PBS, không có khả năng kháng sau khi ngâm trong PBS 2 ngày.
+ Màng T: chỉ có khả năng kháng ở ngày 0.
+ Màng MT: kháng tốt ở ngày 0, khả năng kháng giảm đáng kể sau các ngày ngâm trong PBS, không có khả năng kháng sau khi ngâm trong PBS 4 ngày. - Khả năng kháng Pseudomonas aeruginosa của các màng GA ngâm các thuốc