3.2.1 Vật liệu sinh học
Tôm sú 45 ngày tuổi.
Nƣớc biển đƣợc xử lý các bƣớc: cơ học – hoá học - trung hoà. Dòng virus WSSV-VN đã đƣợc chuẩn độ:105,2SID50/ml.
Vitamine C dạng muối polyphosphate - sản phẩm C Vits của công ty Svaks, Ấn Độ.
β-1,3/1,6-glucan - sản phẩm PIOMOS của công ty PIOTECH, Mỹ. Thức ăn viên C.P 9003-P sản xuất tại Công ty TNHH Chăn nuôi C.P. Việt Nam.
3.2.2 Dụng cụ và hoá chất 3.2.2.1 Dụng cụ
a) Dụng cụ cho quản lý bể nuôi tôm Bể composite 1 m3.
Máy bơm, vợt, máy đo thủy hoá… b) Dụng cụ gây nhiễm WSSV cho tôm
Kim Isulin 0,5 ml, cỡ đầu kim 26.
Micropipet 100 µl, 1000 µl, eppendoff 2 ml, găng tay, bông gòn tiệt trùng.
Bể kính 126 lit.
Vợt và thức ăn tôm lớn. c) Dụng cụ cho IHC
Panh, dao, kéo vô trùng.
Máy xử lý mẫu tự động, máy cắt microtome, tủ ấm 37oC, bàn làm lạnh mẫu, nồi nƣớc ấm, bình rót paraffin electrothermal, kính hiển vi quang học.
3.2.2.2 Hoá chất
a) Hóa chất cho quản lý bể nuôi tôm
Chlorine, Na2S2O3 để xử lý nƣớc biển.
Hóa chất dùng phân tích mẫu nƣớc: NaOH, KI, KMnO4, Na2S2O3, H2SO4, hồ tinh bột,...
b) Hóa chất cho gây nhiễm WSSV cho tôm
Dung dịch đệm BPS 10X (1000 ml): + Na2HPO4: 96,72 g + KH2PO4: 20,005 g + KCl: 19,98 g Cồn 70%
c) Hóa chất cho IHC:
Cồn 50, 70, 95 và 99,6%.
Parafin, nƣớc cất khử ion, Tris–NaCl, Tris–HCl, xylene.
Thuốc nhuộm Hematoxylin, keo dán Baume Canada, chloroform. Dung dịch Davidson có thành phần nhƣ sau:
+ Cồn 95%: 330 ml + Formalin: 220 ml + Acid acetic glacial: 115 ml + Nƣớc cất: 335 ml Hoá chất là lam dƣơng:
+ Aceton: 250 ml + (3 – amino propyl) triethoxysaline: 5 ml
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1 Phƣơng pháp pha loãng dịch huyền phù virus
Từ dịch huyền phù virus ban đầu (10oC) hút 100 µl cho vào eppendorf có chứa 900 µl dung dịch BPS 1X. Ta đƣợc độ pha loãng 10-1.
Hút 100 µl từ độ pha loãng 10-1 cho vào eppendorf chứa 900 µl dung dịch BPS 1X. Ta đƣợc độ pha loãng 10-2.
Tiếp tục làm nhƣ trên, ta sẽ đƣợc độ pha loãng mong muốn.
3.3.2 Phƣơng pháp gây nhiễm virus WSSV trên tôm sú
Mỗi tôm đƣợc tiêm 100 µl dịch virus WSSV-VN đã chuẩn độ vào giữa mặt bên của đốt thứ 2 hoặc 3.
3.3.3 Phƣơng pháp thu mẫu cho IHC
Cắt đầu tôm, tách vỏ, lấy phần mang và gan tụy, để vào mảnh vải mùng nhỏ, cho vào cassette, đóng nắp và ngâm trong dung dịch Davidson trong thời gian từ 24 – 48 giờ. Tỷ lệ mẫu : Davidson = 1 : 10
3.3.4 Phƣơng pháp xác định WSSV trên tôm sú bằng kỹ thuật IHC
Để đáp ứng mục tiêu là chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng trên tôm sú, trong điều kiện của phòng thí nghiệm, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp ABC (avidin-biotin complex) theo protocol của Đại học Ghent (Bỉ). Trong đó, ta tiến hành nhộm mẫu với kháng thể sơ cấp 8B7 của chuột kháng protein WSSV VP28 (WSSV - 8B7 mAb) (4oC) (công ty Diagxotics), kháng thể thứ cấp gắn biotin, phức hợp streptavidin-biotinylated horseradish peroxidase và cơ chất là 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB). Đọc kết quả trên kính hiển vi quang học ở vật kính 10X,
40X, 100X. Tế bào nhiễm WSSV có thể vùi dạng Crowdry A đặc trƣng, nhân trƣơng to và bắt màu nâu. Quy trình thực hiện:
3.3.5 Phƣơng pháp xác định tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV trên tôm thí nghiệm
Đọc mẫu nhuộm IHC dƣới kính hiển vi quang học (vật kính 40X). Chọn vùng mô có nhiều tế bào nhiễm WSSV nhất, đếm số tế bào nhiễm và tế bào không nhiễm. Từ đó tính tỷ lệ tế bào nhiễm TLN (%):
3.3.6 Phƣơng pháp đo một số yếu tố môi trƣờng nƣớc
Đo nhiệt độ bằng nhiệt kế bách phân. Đo NH3: đo bằng bộ test nhỏ giọt Vera. Đo pH: đo bằng pH kế Scan 2.
Xác định Oxy hoà tan (DO) theo phƣơng pháp chuẩn độ Winkler trong thí nghiệm.
3.3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số tế bào nhiễm TLN (%) =
Số tế bào không nhiễm X100 Ủ mẫu trong 24 – 72 giờ
giờ . Nhận mẫu Cố định mẫu Xử lý mẫu Đúc mẫu 12,5 giờ Cắt mẫu Làm lạnh
Chuyển mẫu lên lam
Ủ mẫu ở 40oC đến khi mẫu dính chặt vào lam
Nhuộm và đọc kết quả dƣới kínhhiển vi
Xử lý số liệu bằng phần mềm thống kê Stagraphics 7.0.
3.4 Bố trí thí nghiệm:
3.4.1Chuẩn bị vật liệu cho thí nghiệm gây nhiễm chuẩn
Bố trí 3 bể composite 1 m3
Vì số lƣợng tôm cần cho gây nhiễm chuẩn 66 con/nghiệm thức nên chúng tôi bố trí: 100 con tôm/bể.
Phƣơng thức Bể Thức ăn viên + chất kích thích miễn dịch IM1 100 con IM2 100 con
Thức ăn viên C 100 con
Bảng 3.1 Bố trí nuôi tôm sú với các phƣơng thức quản lý khác nhau
IM1: Thức ăn viên trộn vitamin C với lƣợng 5 g/kg thức ăn.
IM2: Thức ăn viên trộn -1,3/1,6-glucan với lƣợng 10 g/kg thức ăn.
Cách trộn: cân hợp chất, trộn trong dầu mực và áo bên ngoài viên thức ăn, để khô 60 phút rồi cho ăn.
Tôm ở mỗi bể đƣợc cho ăn 3% trọng lƣợng cơ thể /ngày, chia làm 5lần: 7, 11, 15, 19 và 23 giờ.
Chỉ tiêu đƣợc duy trì ổn định:
+ Nhiệt độ: 27oC + Độ mặn: 20o/oo + Độ kiềm tổng: 120 mg/L Chỉ tiêu môi trƣờng nƣớc đƣợc theo dõi:
+ Trong ngày: pH, oxy hòa tan (DO) ở 8 giờ và 14 giờ. + Trong tuần: Amoniac ở 8 giờ ngày đầu tuần.
Tôm đƣợc nuôi và cho ăn 15 ngày và chuyển sang bố trí thí nghiệm gây nhiễm chuẩn WSSV.
3.4.2Bố trí thí nghiệm gây nhiễm chuẩn cho tôm với dịch virus WSSV-VN đã chuẩn độ (105,2SID50/ml) chuẩn độ (105,2SID50/ml)
Tiến hành 2 thí nghiệm gây nhiễm chuẩn cho tôm với 2 nồng độ của dịch virus WSSV-VN đã đƣợc chuẩn độ xác định liều gây nhiễm 50% tôm thí nghiệm (105,32SID50/ml) là: liều thấp (101.5SID50) và liều cao (104SID50).
Mỗi thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD), 3 nghiệm thức (β-1,3/1,6-glucan, vitamin C và đối chứng) Mỗi nghiệm thức bố trí 11 bể gây nhiễm cho 11 đợt thu mẫu + 1 bể đối chứng tiêm PBS. Số tôm ở mỗi bể là 3 con cho 3 lần lặp lại.
Thời gian thu mẫu tôm:
Bảng 3.2 Các thời điểm thu mẫu ở mỗi đợt thí nghiệm.
0 giờ 12 giờ 24 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ 72 giờ 84 giờ 96 giờ 108 giờ 120 giờ
Ghi chú: Thu ở 0 giờ là để xem hiệu quả tiêm.
Các nghiệm thức đƣợc cho ăn ngày 3 lần: 8, 13 và 18 giờ. Chỉ tiêu đƣợc duy trì ổn định:
+ Nhiệt độ: 27oC + Độ mặn: 20o/oo + Độ kiềm tổng: 120 mg/L
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Đánh giá nguồn vật liệu phục vụ cho thí nghiệm gây nhiễm chuẩn
Nhìn chung, trong suốt 15 ngày nuôi, qua các chỉ tiêu theo dõi, nhận thấy điều kiện môi trƣờng nuôi là phù hợp cho tôm nuôi ở cả 3 phƣơng thức quản lý.
Bảng 4.1 Kết quả theo dõi các chỉ tiêu môi trƣờng trong quá trình nuôi (Phụ lục 1)
Tốc độ tăng trọng của tôm:
Bảng 4.2 Tốc độ tăng trọng trung bình của tôm sau 15 ngày nuôi
Phƣơng thức Tăng trọng trung bình (g/ngày)
β-1,3/1,6-glucan 0,078
Vitamin C 0,138
Đối chứng 0,094
Trong quá trình nuôi, tôm ở 3 phƣơng thức quản lý có biểu hiện bình thƣờng. Tôm chết trong quá trình nuôi là do ăn nhau khi ở giai đọan lột xác. Đến cuối đợt, số tôm còn lại ở mỗi bể:
-1,3/1,6-glucan: 98 con (98% số tôm ban đầu).
Vitamin C: 98 con (98% số tôm ban đầu).
Đối chứng: 95 con (95% số tôm đầu)
Nhìn chung đã tạo đƣợc nguồn tôm phù hợp cho các thí nghiệm gây nhiễm chuẩn tiếp theo.
Hình 4.1 Bể nuôi tôm với hệ thống lọc tuần hoàn
Phƣơng thức Khoảng dao động pH Nhiệt độ Amoniac Oxy hòa tan β-1,3/1,6 -glucan 7,35 – 7,72
28oC <1mg/L > 6 mg/L
Vitamin C 7,37 – 7,69
4.2. Khảo sát ảnh hƣởng của các phƣơng thức quản lý khác nhau lên độ mẫn cảm của tôm sú đối với WSSV của tôm sú đối với WSSV
4.2.1. Kết quả ở thí nghiệm gây nhiễm WSSV trên tôm sú với liều thấp (101,5SID50)
Kết quả theo dõi thực nghiệm cho thấy, tôm ở nghiệm thức đối chứng có biểu hiện bất thƣờng xuất hiện sớm nhất sau gây nhiễm WSSV so với 2 nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan và vitamin C. Cụ thể, tôm ở nghiệm thức này có dấu hiệu đỏ đuôi ở 20 giờ, đỏ thân ở 24 giờ sau gây nhiễm, trong khi hai nghiệm thức còn lại dấu hiệu đỏ thân xuất hiện trễ hơn (Bảng 4.3). Dấu hiệu điển hình của bệnh đốm trắng xuất hiện sớm nhất là ở nghiệm thức đối chứng (33 giờ). Tôm bị chết sớm nhất là ở nghiệm thức đối chứng (49 giờ sau gây nhiễm) và trễ nhất là ở nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan (83 giờ sau gây nhiễm). Kết thúc thí nghiệm gây nhiễm với liều thấp, số tôm chết đƣợc ghi nhận ở cả 3 nghiệm thức đối chứng, vitamin C và β-1,3/1,6-glucan lần lƣợt là 7, 6 và 5 con đều cho kết quả IHC dƣơng tính với WSSV. Tôm đối chứng tiêm PBS vẫn khỏe đến cuối đợt thí nghiệm.
Bảng 4.3 Kết quả theo dõi thực nghiệm dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng sau khi gây nhiễm liều thấp
Nghiệm thức
Thời điểm xuất hiện đỏ thân (giờ)
Thời điểm xuất hiện đốm trắng (giờ)
Thời điểm tôm bị chết (giờ) Tổng số tôm chết β-1,3/1,6-glucan 27 44 83 5 Vitamin C 33 49 68 6 Đối chứng 24 33 49 7
Kết quả phân tích tại phòng thí nghiệm về tỷ lệ và cƣờng độ cảm nhiễm của WSSV bằng IHC cho thấy, ở cả ba nghiệm thức tôm đã bị nhiễm WSSV ở thời điểm 24 giờ sau gây nhiễm. Ở thời điểm 24 giờ đã quan sát thấy tế bào tôm bị nhiễm WSSV đƣợc thu mẫu từ tôm ở cả 3 nghiệm thức (Hình 4.2).
Hình 4.2 Hình chụp mẫu mô mang của tôm đƣợc nhuộm IHC (vật kính 40X) thời điểm 24 giờ sau gây nhiễm WSSV
A: Nghiệm thức -1,3/1,6-glucan, B: Nghiệm thức vitamin C, D: Đối chứng ( chỉ tế bào nhiễm WSSV)
Kết quả ghi nhận về cƣờng độ nhiễm WSSV bằng IHC, đƣợc đánh giá thông qua tỷ lệ (%) tế bào nhiễm trên tổng số tế bào không nhiễm trong một thị trƣờng tại vùng có mật độ tế bào nhiễm WSSV cao nhất của mô mang, cho thấy tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV trên lô đối chứng là cao nhất (Bảng 4.4), tỷ lệ tế bào nhiễm trung bình trên vùng khảo sát là 4,94%, kế đến là nghiệm thức cho ăn thức ăn trộn β-1,3/1,6- glucan (4,12%) và thấp nhất là nghiệm thức cho ăn thức trộn vitamin C (3,49%). Tuy nhiên, khi xử lý thống kê trên toàn bộ dữ liệu ghi nhận không có sự khác biệt có ý nghĩa (P>0,05) về tỷ lệ tế bào nhiễm trên vùng khảo sát giữa ba nghiệm thức (Phụ lục 3)
Bảng 4.4 Kết quả tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) của tôm kiểm tra bằng IHC ở liều thấp Nghiệm thức Tỷ lệ nhiễm WSSV trung bình (%) -1,3/1,6-Glucan 4,12 Vitamin C 3,49 Đối chứng 4.94
Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) của tôm ở liều thấp
Ở nghiệm thức đƣợc bổ sung vitamin C, qua các thời điểm thu mẫu từ 24 – 84 giờ, có thể nhận thấy tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV có khuynh hƣớng thấp hơn nghiệm thức bổ sung β-1,3/1,6-glucan và đối chứng. Tuy nhiên ở các thời điểm thu mẫu tiếp theo 96, 108, 120 giờ, tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của nghiệm thức này tăng lên cao hơn nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan và không cách biệt lắm so với đối chứng (Biểu đồ 4.2).
Bảng 4.5 Kết quả kiểm tra tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) trên tôm bằng IHC theo thời gian thu mẫu ở liều thấp
Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV trung bình (%)
Nghiệm
Thức 0giờ 12giờ 24giờ 36giờ 48giờ 60giờ 72giờ 84giờ 96giờ 108giờ 120giờ
B 0 0 1,94 5,75 4,53 9 5,48 13,57 1,59 2,28 1,19
V 0 0 0,37 3,47 3,98 6,34 2,23 3,06 4,75 8,09 6,16
Đ 0 0 0,8 5,49 7,82 6,93 11,51 6,03 4,91 4,19 6,7
Ghi chú:
B: β-1,3/1,6-glucan, V:vitamin C, Đ: đối chứng
Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) của tôm theo thời gian ở liều thấp
Biểu đồ tỷ lệ tế bào nhiễm WS S V (%) của tôm ở liều thấp 4,12 3,49 4,94 0 1 2 3 4 5 6 β-1,3/1,6- glucan Vitamin C Đối chứng Nghiệm thức Tỷ l ệ tế b ào n h iễ m WS S V (%) β-1,3/1,6- glucan Vitamin C Đối chứng
Biểu đồ tỷ lệ tế bào nhiễm WS S V (%) của tôm theo thời gian ở liều thâp
0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120
Thời gian thu mẫu (giờ)
Tỷ l ệ n hi ễm WS SV (%) β-1,3/1,6- glucan Vit amin C Đối chứng
Trái lại, ở nghiệm thức bổ sung β-1,3/1,6-glucan, nhìn chung tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV có chiều hƣớng cao hơn nghiệm thức bổ sung vitamin C và không cách biệt lắm với nghiệm thức đối chứng ở các thời điểm thu mẫu từ 24 – 84 giờ. Ở các thời điểm 96, 108, 120 giờ sau gây nhiễm, tỷ lệ nhiễm WSSV của nghiệm thức này giảm và thấp so với 2 nghiệm thức còn lại.
Nhận xét và thảo luận:
Tác động của các giải pháp quản lý đƣợc áp dụng ở đây thể hiện rất rõ qua kết quả theo dõi thực nghiệm. Thời điểm xuất hiện dấu hiệu bệnh tích đầu tiên của bệnh đốm trắng có chậm đi ở 2 nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan và vitamin C. Thời điểm tôm bị chết cũng muộn hơn và số tôm chết ở 2 nghiệm thức này cũng thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng.
Ở nghiệm thức bổ sung vitamin C, tỷ lệ nhiễm WSSV trên tôm thấp trong thời gian đầu (24 – 84 giờ) và cao hơn ở 96, 108 và 120 giờ. Điều này có thể do tác dụng kích thích của vitamin C lên hoạt động của hệ miễn dịch giảm dần theo thời gian sau khi tôm bổ sung vitamin C đƣợc gây nhiễm WSSV. Theo López và ctv (2003) cho thấy ở tôm thẻ chân trắng (Litopeneaus vannamei) sau khi đƣợc bổ sung vitamin C, các thành phần của hệ miễn dịch nhƣ tổng lƣợng tế bào máu, số tế bào hạt (granular cells), proPO đều tăng cao hơn nghiệm thức đối chứng. Có thể ở tôm sú cũng có hiện tƣợng tƣơng tự. Theo tác giả này vitamin C có tác dụng cải thiện sức khỏe, tăng cƣờng các quá trình trao đổi chất ở tôm. Ngoài ra, vitamin C còn đƣợc chứng minh có tác dụng kích thích miễn dịch trên tôm sú (Marchie và ctv, 1998).
Ở nghiệm thức bổ sung β-1,3/1,6-glucan, tỷ lệ nhiễm WSSV cao trong thời gian đầu (24 – 84 giờ) và giảm dần ở các thời điểm thu mẫu tiếp theo. Điều này có thể do đặc điểm tác động của β-glucan. Theo López và ctv (2003), β-glucan có tác dụng kích thích hệ miễn dịch của tôm và luôn duy trì nó ở trạng thái báo động. Khi đƣợc tiếp xúc với stress, tôm có thể chịu đựng đƣợc. Tuy nhiên tác dụng này chỉ ở thời điểm đáp ứng với stress và sau đó hệ miễn dịch có hiện tƣợng mệt mỏi.Trong thí nghiệm của chúng tôi, có thể do quá trình chuyển tôm từ bể 1 m3 lên phòng thí nghiệm gây nhiễm, khi tiêm virus đã gây stress cho tôm. Đến khi WSSV bắt đầu tấn công thì hệ miễn dịch của tôm đang ở tình trạng mệt mỏi sau khi đáp ứng với stress nên tỷ lệ nhiễm WSSV cao, tuy nhiên không khác biệt lắm so với nghiệm thức đối chứng. Ở các thời điểm thu mẫu 96, 108 và 120 giờ nhận thấy tỷ lệ nhiễm WSSV giảm có thể do có hiện tƣợng phục
hồi miễn dịch. Trong một nghiên cứu của Chang và ctv (2003), sau một thời gian gây nhiễm WSSV nhất định thì các thành phần trong hệ miễn dịch của tôm có bổ sung β-glucan bắt đầu phục hồi: sau 3 ngày hoạt tính prophenoloxidase đƣợc phục hồi và sau 9 ngày thì tổng lƣợng tế bào máu, hoạt tính superoxide dismutase đƣợc phục hồi,…Trong thí nghiệm của chúng tôi sự phục hồi của hệ miễn dịch sớm hơn có thể là do ảnh hƣởng các yếu tố nhƣ độc lực virus gây nhiễm, nguồn gốc và thời gian bổ sung β-glucan, cách thức gây nhiễm, tuổi của tôm… Tuy nhiên kết quả trùng hợp là đến 120 giờ chƣa thấy sự phục hồi ở lô đối chứng. Kết quả này bƣớc đầu khẳng định hiệu
