3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3. Phƣơng pháp nhân giống và trồng nấm
3.3.1. Môi trƣờng Môi trƣờng thạch (PGA) Khoai tây Glucose Agar Môi trƣờng hạt Cám gạo CaCO3 Lúa
Môi trƣờng giá môi Khoai mì Cám gạo KH2PO4 MgSO4 CaCO3 Môi trƣờng giá thể Mùn cƣa Cám gạo KH2PO4 MgSO4
3.3.2. Phƣơng pháp
3.2.2.1. Chuẩn bị môi trƣờng PGA
- Khoai tây bóc vỏ, rửa sạch. Cân 200 g, đun sôi, lọc lấy nuớc.
- Thêm 20 g agar, cho thêm nƣớc cất để đủ 1 lít, đun tan agar.
- Cho vào ống nghiệm (khoảng 1/5 so với chiều cao ống nghiệm), đậy nút bông.
- Hấp khử trùng ở 121oC, 1.2 atm, trong 20 phút.
- Lấy ra, để nghiêng chuẩn bị cho cấy chuyền.
- 5 dòng nấm bào ngƣ sau khi đem về phòng thí nghiệm, đƣợc tiến hành cấy chuyền sang môi trƣờng thạch nghiêng PGA..
3.2.2.2. Chuẩn bị môi trƣờng hạt
- Lúa đƣợc đun sôi, nứt nanh, trộn với CaCO3 (2%) , cám gạo (10%).
- Cho vào bình tam giác, hoăc bình thủy tinh, hấp khử trùng ở 121oC, 1,2 atm, trong 90 phút.
- Khi tơ nấm phát triển đầy ống nghiệm, chúng sẽ đƣợc cấy sang môi trƣờng hạt. đem để trong bóng tối. Tùy theo mỗi loài mà thời gian phát triển đầy bình sẽ khác nhau. Trong quá trình đó, chuẩn bị môi trƣờng giá môi.
3.3.2.3. Chuẩn bị môi trƣờng giá môi
- Cọng mì đƣợc cắt khoảng 15 – 20 cm, tùy theo kích thƣớc của túi ny lông, ngâm khoảng 24 giờ, trộn với một số hóa chất khác nhƣ KH2PO4, MgSO4 với tỉ lệ nhất định ( 2% đối với MgSO4 và 1 % đối với KH2PO4).
- Hấp khử trùng ở 121oC , 1,2 atm trong 90 phút.
- Khi tơ nấm phát triển đầy bình tam giác, tạo ra màu trắng mịn trong bình, cấy sang môi trƣờng giá môi.
3.2.2.4. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi trồng
- Mùn cƣa đƣợc sàn lọc loại bỏ rác và những mảnh có kích thƣớc lớn.
- Ngâm trong nƣớc vôi 5% trong 24 giờ
- Bổ sung cám gạo, bột bắp, cho vào túi ny lông hoặc bình thủy tinh.
- Hấp khử trùng trong 90 phút, 1atm, 121oC để 2 ngày sau hấp khử trùng tiếp nhƣ lần thứ nhất.
- Cấy giống từ môi trƣờng giá môi sang.
- Ủ trong tối, khi nào thấy tơ phát triển đầy trắng , phủ kín bịt phôi, có những giọt nƣớc li ti trên thành túi thì tiến hành cắt túi bằng dụng cụ đã khử trùng.
- Đem ra nhà nuôi trồng, tƣới và đón nấm
- Nấm sau khi hái, đƣợc cân tính trọng lƣợng tƣơi, sau đó đem sấy khô, bảo quản trong tủ lạnh, để chuẩn bị cho phân tích amino acid.
- Tiếp tục tƣới và đón nấm.
- Sau khi hái nấm lần hai, nấm lƣợng nấm cũng đƣợc đem cân trọng lƣợng tƣơi, cơ chất đem sấy khô, tính trọng lƣợng của chúng.
- Tính năng suất sản phẩm.
- Tất cả nấm hái đƣợc đem đo đƣờng kính để tính trung bình.
3.2.2.5. Tóm tắt quy trình [1, 2] Tƣới đón nấm Thu quả thể Môi trƣờng hạt - Lúa nấu (88 %) - CaCO3 (2%) - Cám gạo (10%)
Môi trƣờng giá môi
- Cọng mì (87 %) - MgSO4 ( 2%) - KH2PO4 (1 %) - Cám gạo (10 %) - Mùn cƣa (84 %) - Cám gạo (10 %) - Bột bắp(5,5 %) - KH2PO4 (0,5 %) Giá thể trồng Giống nấm - Khoai tây 200 g / lít - Glucose 20 g / lít - Agar 20 g / lít Cấy sang môi trƣờng giá môi ủ trong tối
3.3.3. Phân tích amino acid
Mẫu nấm sau khi thu hoạch đƣợc đem phân tích thành phần amino acid.
Chúng tôi tiến hành phân tích 2 trên 4 mẫu: Pleurotus pulmonarius, Pleurotus flabellatus.
Quá trình phân tích thành phần amino acid trong 2 loại nấm trên đƣợc thực hiện theo quy trình Thomas T. Andersen và cộng sự.
3.3.3.1.Thủy phân mẫu
- Cho 2 g mẫu đã đƣợc cắt nhỏ vào tube chịu nhiệt và làm khô.
- Thêm vào 10 ml dung dịch HCl 6N.
- Loại bỏ không khí bằng cách thổi khí trơ vào khoảng không của tube đựng dung dịch mẫu.
- Thủy phân ở 152o
C trong 1h.
- Lấy ra, để nguội, lọc qua giấy lọc.
- Cho vào lọ, dán nhãn và để trong tủ mát.
Với nhiệt độ cao và trong điều kiện acid có nồng độ cao (HCl 6N), các protein sê đƣợc phân cắt thành những amino acid đơn (Hình 2.10).
3.3.3.2. Tạo dẫn xuất
Khi phân tích thành phần amino acid trên HPLC, mẫu phải đƣợc tạo dẫn xuất với PITC để có thể phát hiện thông qua detector. Quá trình tạo dẫn xuất đƣợc thực hiện nhƣ sau:
- Hút 2µl mẫu cho vào bình quả lê có đáy nhọn.
- Làm khô bằng hỗn hợp dung dịch ethanol, nƣớc và TEA với tỷ lệ tƣơng ứng 2:2:1. Quá trình này đƣợc thực hiện trong điều kiện có thổi khí trơ để loại bỏ những acid còn thừa lại trong quá trình thủy phân cũng nhƣ giúp cho PITC có thể bắt với từng amino acid dễ dàng hơn. Bởi vì dƣới tác động của phức hợp này đăc biệt là TEA giúp cho những amino sẽ bị khử 1 proton, khi đó PITC sẽ gắn vào.
- Mẫu đƣợc tạo dẫn xuất với dung dịch ethanol: nƣớc: TEA: PITC = 7:1:1:1 khoảng 5 đến 10 phút ở trong tối. Khi đó PITC sẽ gắn vào đầu amin của các amino acid (Hình 2.11), Theo Molnar-Perl, (1994), phản ứng gắn này rất bền, nếu bảo quản trong điều kiện lạnh chúng sẽ ổn định ít nhất 6 tháng).
- Mẫu phân tích đƣợc đem đi thổi khô với khí trơ. Bƣớc quan trọng nhất trong quá trình tạo dẫn xuất là loại bỏ những tác nhân sau khi dẫn xuất. Điều này đƣợc thực
hiện trong điều kiện chân không thổi khí trơ hoặc trích với heptane (Thomas T. Andersen, 1995). Với điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi tiến hành bằng phƣơng
pháp thổi khô với khí trơ. Nếu PITC không đƣợc loại thải tốt thì nó sẽ làm hƣ cũng nhƣ phá hủy cột HPLC.
- Mẫu đƣợc pha loãng trong 2 ml dung dịch pha loãng trong mẫu và đƣợc lọc qua bộ phận lọc đƣờng kính 20 µm để chuẩn bị cho phân tích HPLC.
3.3.3.3. Phân tích HPLC
Quá trình thực hiện phân tách trên HPLC đƣợc thực hiện với: Buffer A: sodium acetate và TEA, pH 6,8.
Buffer B: 60% acetonitile, nƣớc 40% (v/v). Cột: Pico- Tag, 3.9 mm x 15 cm.
Detector: Ultra-violet (UV). Tốc độ dòng: 1 ml / phút. Bƣớc sóng: 254 nm. Quá trình thực hiện:
- Hút 20 µl dung dịch chuẩn 17 amino acid, bơm và theo dõi.
- Lƣu lại các thông số cần thiết để tiến hành định tính cũng nhƣ định lƣợng (thời gian lƣu, diện tích peak,…)
- Hút 20 µl mẫu, tiến hành tƣơng tự nhƣ đối với chuẩn.
3.3.3.4. Phân tích và tính toán kết quả
Sau khi bơm chuẩn, ta sẽ có những dữ liệu thu từ máy tính nhƣ là thời gian phát hiện peak, diện tích của từng peak thể hiện trên sắc ký đồ. Các thông số này đƣợc lƣu lại để tính hay để định lƣợng cho mẫu phân tích. Có rất nhiều cách để định lƣợng amino acid đơn:
Dùng chuẩn với các nồng độ khác nhau, sau đó lập phƣơng trình hồi quy giữa diện tích peak và nồng độ với hệ số tƣơng quan xác định. Từ diện tích peak của mẫu đã biết qua quá trình chạy ta có thể tính nồng độ tƣơng ứng cho từng amino acid. Đây là phƣơng pháp chính xác nhất để tính nồng độ các amino acid.
Chỉ bơm chuẩn 1 lần, ghi lại các diện tích peak thu đƣợc trên sắc ký đồ sau khi phân tích kết thúc. Sau đó lặp tỷ lệ giữa diện tích peak và nồng độ của chuẩn và mẫu, từ đó tính đƣợc nồng độ từng amino acid trong mẫu.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả trồng nấm
4.1.1. Sự tăng trƣởng của hệ sợi trên các môi trƣờng
Sau khi chúng tôi thực hiện nuôi trồng theo quy trình ở mục 3.2.2.5, chúng tôi đạt đƣợc một số kết quả trình bày ở bảng 4.1.
Nhận xét:
Tất cả các loài nấm đều đƣợc thực hiện đều đƣợc tiến hành trên các thiết bị giống nhau tƣơng ứng với từng môi trƣờng (môi trƣờng lúa trong bình tam giác, môi trƣờng cọng mì trên túi ny lông) khi chuyển sang môi trƣờng nuôi trồng, chúng tôi thực hiện Pleurotus floridanus, Pleurotus abalonus trên túi ny lông, đồng thời với hai loại Pleurotus flabellatus, Pleurotus pulmonarius chúng tôi thực hiện trên những lọ bằng thủy tinh. Vì thế, chúng tôi chỉ so sánh trên hai môi trƣờng đầu với 4 dòng nấm còn môi trƣờng nuôi trồng chúng tôi phân ra từng cặp để so sánh.
Với kết quả thu đƣợc (Bảng 4.1), chúng tôi nhận thấy rằng:
Thời gian tăng trƣởng trên môi trƣờng hạt của Pleurotus abalonus là chậm nhất, kế đến là Pleurotus floridanus; Pleurotus flabellatus và Pleurotus pulmonarius
có thời gian tăng trƣởng tƣơng đƣơng nhau. Cả 3 dòng nấm Pleurotus floridanus;
Pleurotus flabellatus và Pleurotus pulmonarius đều có hệ sợi tơ trắng nhƣng Pleurotus floridanus thì trắng hơn và hệ sợi không thƣa nhƣ hai dòng còn lại (Hình 4.1)
Khi cấy sang môi truờng giá môi, thì kết quả cũng giống nhƣ trên môi trƣờng hạt, thời gian sinh trƣởng của Pleurotus abalonus vẫn là chậm nhất. Và trên môi trƣờng này, thì nấm này vẫn khác so với các nấm còn lại là trên đầu mỗi sợi nấm có màu đen, trong đó chứa các bào tử.( Hình 4.2 và Hình 4.3).
Bảng 4.1. Thời gian lan tơ đầy của các dòng nấm
Dòng nấm Môi trƣờng lúa Môi trƣờng giá môi Môi trƣờng nuôi trồng Pleurotus pulmonarius Pleurotus flabellatus Pleurotus floridanus Pleurotus abalonus 15 ngày 15 ngày 18 ngày 30 ngày 17 ngày 18 ngày 20 ngày 40 ngày 25 ngày 27 ngày 30 ngày 40 ngày
4.1.2. Sự hình thành quả thể
Năng suất sản phẩm = Trọng lƣợng nấm tƣơi / Trọng lƣợng cơ chất khô Về hình thái
Sau khi đem ra nhà trồng, tuới đón nấm, chúng tôi đã thu đƣợc hình thái của 4 dòng nấm nhƣ sau
- Pleurotus floridanus (Hình 4.1) quả thể màu trắng, hơi phủ lông mịn ở gốc. các quả thể mọc thành từng chùm. Khi đem quan sát duới kính hiển vi có thể thấy đƣợc bào tử đảm (Hình 4.4)
- Pleurotus abalonus (Hình 4.2) quả thể có màu trắng đục, rất dày, chắc, trên bề mặt có những vảy nhỏ. Cuống nấm cũng rất to. Đem quan sát dƣới kính hiển vi quang học, chúng tôi cũng thấy đƣợc bào tử đảm tuơng đối lớn hơn so với
Pleurotus floridanus (Hình 4.5)
- Pleurotus pulmonarius (Hình 4.3) Phiến nấm mỏng, có màu trắng hơi ngả xám, hơi xẻ thùy ở mặt ngoài của phiến
- Pleurotus flabellatus (Hình 4.4) phiến nấm có màu xám đậm, cánh mỏng, rất giống với Pleurotus pulmonarius.
Nhƣ vậy , về hình thái 4 dòng nấn này hoàn toàn khác nhau. Pleurotus abalonus
có quả thể to và dày nhất, kế đến là Pleurotus floridanus; hai loài còn lại về mặt hình thái tƣơng đối giống nhau, chỉ khác nhầumu sắc trên mặt phiến nấm.
Về năng suất sản phẩm: năng suất sản phẩm đƣợc tính bằng trọng lƣợng nấm tƣơi/trọng ƣợng cơ chất khô. Theo bảng 4.2 thì năng suất của Pleurotus floridanus cao nhất. Các dòng còn lại năng suất cũng tƣơng đối cao.
Bảng 4.2. Đặc tính quả thể của các loài nấm Loài nấm Đƣờng kính trung bình quả thể Năng suất sản phẩm (%) Pleurotus floridanus Pleurotus abalonus Pleurotus pulmonarius Pleurotus flabellatus. 8 cm 13 cm 11 cm 10 cm 70 62 60 56
Bào tử đơn Hình 4.1. Sinh trƣởng tơ nấm trên môi trƣờng lúa của
Pleurotus floridanus, Pleurotus flabellatus, Pleurotus flabellatus
Hình 4.3. Bào tử Pleurotus abalonus quan sát trên hệ sợi tơ (bào tử đơn) Hình 4.2. Pleurotus abalonus trên môi trƣờng
thân cây mì bổ sung MgSO4 ( 2%),
KH2PO4 (1 %), Cám gạo (10 %)
Thân cây mì
Bào tử đảm
Hình 4.4. Bào tử đảm quan sát trên quả thể của nấm Pleurotus floridanus
Bào tử đảm
Hình 4 .5. Bào tử đảm quan sát trên quả thể nấm Pleurotus abalonus
4.2. Kết quả phân tích amino acid
Sau khi tiến hành phân tích, trên 2 dòng nấm Pleurotus pulmonaius, Pleurotus flabellatus trên HPLC,chúng tôi đã thu đƣợc thành phần của từng amino acid đƣợc liệt kê trong bảng 4.3.
Hình 4.6. Quả thể nấm Pleurotus floridanus trên túi ny lông chứa mùn cƣa có bổ sung:
Cám gạo (10 %) Bột bắp(5,5 %) KH2PO4 (0,5 %)
Quả thể
Hình 4.7. Quả thể nấm Pleurotus abalonus
trên túi ny lông chứa mùn cƣa có bổ sung: Cám gạo (10 %) Bột bắp(5,5 %)
KH2PO4 (0,5%) ) Quả thể
Hình 4.8 Quả thể nấm Pleurotus flabellatus
trênbình thủy tinh chứa mùn cƣa có bổ sung
Cám gạo (10 %) Bột bắp(5,5 %) KH2PO4 (0,5%)
Quả thể
Hình 4.9 Quả thể nấm Pleurotus pulmonarius
trênbình thủy tinh chứa mùn cƣa có bổ sung:
Cám gạo (10 %) Bột bắp(5,5 %) KH2PO4 (0,5%)
Hình 4.9. Sắc ký đồ chuẩn amin acid
ASP: Aspartic acid; GLU Glutamate; SER: Serine; GLY: Glycine ; HIS: Histidine ARG:
Arginine; THR: Threonine; ALA :Alanine; PRO: Proline; TYR: Tyrosine ; VAL: Valine ; MET:
Methionine; CYS: Cysteine; ILEU: Isoleucine; LEU: Leucine; PHE : Phenylalanine; LYS: lysine
Hình 4.10. Sắc ký đồ của mẫu nấm Pleurotus flabellatus
ASP: Aspartic acid; GLU Glucine; SER: Serine; GLY: Glycine ; HIS: Histidine ARG: Arginine;
THR: Threonine; ALA :Alanine; PRO: Proline; TYR: Tyrosine ; VAL: Valine ; MET: Methionine;
Theo bảng này, thì cả trong 2 dòng đều chứa đầy đủ 17 amino acid.
Trong nấm Pleurotus pulmonaius hàm lƣợng Leu chiếm với tỷ lệ cao nhất, trong khi đó thì các amino acid nhƣ Val, Asp, Cys, Met, Ileu, Lys, Glu chiếm với tỷ lệ rất thấp, đặc biệt là Glu chiếm tỷ trọng thấp nhất trong 17 amino acid đƣợc phát hiện. Với nấmPleurotus flabellatus cũng tƣơng tự nhƣ Pleurotus pulmonaius , Leu chiếm tỷ lệ cao nhất trong 17 amino acid; Val chiếm tỷ lệ thấp nhất.
Trong 17 amino acid này, chứa đến 7 trong 8 amino acid thiết yếu (đƣợc in nghiêng trong bản) đối với ngƣời, ngoại trừ Tryp chƣa đƣợc xác định. Những amino acid này cơ thể con ngƣời không thể tổng hợp đƣợc mà phải đƣợc cung cấp từ bên ngoài. Các amino acid thiết yếu này chiếm đến 42 % trong tổng số amino acid đối với
Pleurotus pulmonaius và 44 % trong tổng số amino acid của nấm Pleurotus flabellatus. Tỷ lệ này cao hơn so với nấm rơm (38,2 %) và nấm mỡ (38,4 %) [Nguyễn Lân Dũng, 2002]. Khi đƣợc so sánh với thành phần amino acid với thực vật nhƣ bắp, đậu nành thì thành phần amino acid của nấm bào ngƣ vẫn cao hơn.
Hình 4.11. Sắc ký đồ của mẫu nấm Pleurotus pulmonarius
ASP: Aspartic acid; GLU Gluatamate; SER: Serine; GLY: Glycine ; HIS: Histidine ARG:
Arginine; THR: Threonine; ALA :Alanine; PRO: Proline; TYR: Tyrosine ; VAL: Valine ;
MET: Methionine; CYS: Cysteine; ILEU: Isoleucine; LEU: Leucine; PHE : Phenylalanine;
Bảng 4. 3. Thành phần amino acid trên Pleurotus pulmonaius, Pleurotus flabellatus
Nhƣ vậy, nấm bào ngƣ có thể đƣợc xem nhƣ là một thực phẩm giàu dinh dƣỡng chứa gần nhƣ đầy đủ các amino acid thiết yếu. Thành phần amin acid của nó cao hơn hầu hết các loại rau quả.
Khi so sánh giữa 2 loài nấm, thành phần amino acid (aa) giữa chúng tƣơng đƣơng nhau (đều chứa 17aa). Nhƣng khi xét riêng từng amino acid, thì giữa chúng có sự khác biệt. Glu của nấm Pleurotus flabellatus cao gấp 8 lần so với Glu (chỉ phát hiện ở dạng vết: 0,25 mg) của Pleurotus pulmonaius, và Ileu cũng cao hơn gấp 10 lần. Tất cả các aa còn lại có sự khác biệt không lớn lắm.
Số thứ tự Amino acid Pleurotus pulmonarius
(mg/g) Pleurotus flabellatus (mg/g) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Leucine Glycine Serine Arginine Alanine Proline Histidine Tyrosine Threonine Phenylalanine Valine Asparagine Cysteine Methionine Isoleucine Lysine Glutamate 21, 15 8, 92 7, 74 6, 49 5, 93 4, 50 4, 42 3, 75 3, 67 2, 21 1, 88 1, 88 1, 79 1, 77 1, 31 1, 15 0, 25 17, 15 11, 39 7, 85 5, 26 4, 95 3, 08 5, 48 6, 78 2, 68 0, 97 0, 91 1, 63 2, 59 4, 49 13, 19 0, 89 2, 04
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận.
Đã trồng đƣợc 4 loại nấm bào ngƣ. Trong đó, có hai loài chƣa đƣợc trồng ở Thành Phố Hồ Chí Minh: Pleurotus pulmonarius và Pleurotus flabellatus. Với năng suất sản phẩm đạt đƣợc khoảng 55- 70%, trong điều kiện nhiệt độ 28 20C, ẩm độ 70%.
Bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC, chúng tôi đã phát hiện và định lƣợng đƣợc thành phần amino acid trên 2 loài nấm Pleurotus pulmonarius và Pleurotus flabellatus.
Hai loài này chứa đầy đủ 17 amino acid, trong đó leucine chiếm tỷ lệ cao nhất 21,15% đối với Pleurotus pulmonarius và 17,15% đối với Pleurotus flabellatus. Trong nấm
Pleurotus pulmonarius thì Glutamate chiếm tỷ lệ thấp nhất, nhƣng đối với nấm
Pleurotus flabellatus (0,25%), Valine chiếm tỷ lệ thấp nhất (0,91%).
5.2. Đề nghị
Sau khi phân tích amino acid, nên tiến hành trồng trên các loại cơ chất khác nhau sau đó phân tích tiếp amino acid để xem sự khác biệt do ảnh hƣởng của cơ chất .
PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO