2.2.3.1. Phƣơng pháp quan sát triệu chứng
Dựa trên những mô tả sẵn có về các dạng bệnh virus để phân biệt bệnh virus thực vật với các triệu chứng do viroid, mycoplasma, tuyến trùng, bệnh không truyền nhiễm (do môi trƣờng không thuận lợi) gây ra.
Triệu chứng bệnh virus bao gồm hai nhóm chính là: Nhiễm hệ thống (còn gọi là nhiễm toàn cây) và nhiễm bộ phận (còn gọi là chết hoại cục bộ). Nhóm nhiễm hệ thống thƣờng tạo hiện tƣợng khảm lá (mosaic), còn nhóm nhiễm bộ phận thƣờng tạo vết chết cục bộ (nécrotic local lésion). Một điều cần chú ý là bệnh virus thƣờng có hiện tƣợng mất triệu chứng (latent periode). Hiện tƣợng này đôi lúc gây ra sự nhầm lẫn giữa cây bệnh và cây khỏe.
Cây chỉ thị thực chất cũng là những cây kí chủ (có thể là cây trồng hay cây dại) nhƣng có triệu chứng bệnh rất điển hình và biểu hiện bệnh nhanh. Đây là một phƣơng pháp khá chính xác trong nghiên cứu bệnh virus thực vật.
Cây chỉ thị cũng đƣợc chia làm hai nhóm: Cây nhiễm bệnh cục bộ (tạo ra các vết chết trên lá, thân…) và cây nhiễm bệnh hệ thống ( thƣờng tạo ra triệu chứng toàn thân nhƣ khảm lá, biến vàng, lùn cây…)
2.2.3.3. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng hiển vi điện tử
Trong tế bào kí chủ, virus thƣờng tạo thành các dạng kết tinh vô định hình hoặc có hình dạng đặc trƣng bởi vô số cá thể virus kết hợp với nhau. Các tinh thể này không phải lúc nào cũng có thể quan sát thấy, song ta có thể nhuộm màu rồi quan sát dƣới kính hiển vi quang học thông thƣờng với độ phóng đại 80 lần.
- Phƣơng pháp đơn giản là sử dụng dịch chứa virus chiết từ lá cây bệnh hay đã đƣợc làm tinh khiết cố định bằng hóa chất trên lƣới đồng để quan sát trên kính hiển vi điện tử. Đây là phƣơng pháp trực tiếp và đơn giản nhất.
- Có thể sử dụng kháng huyết thanh khi dùng phƣơng pháp xem trực tiếp để phân biệt trong trƣờng hợp nghi ngờ mẫu lẫn virus khác. Phƣơng pháp này giúp ta xác định hai virus là khác nhau trong một mẫu. Phƣơng pháp này đƣợc gọi là IEM method.
- Ngƣời ta còn dùng lát cắt cực mỏng bằng Ultramicrotom và nhuộm mẫu đƣợc cắt, quan sát sự hiện diện của virus trong mẫu đƣợc cắt.
2.2.3.4. Phƣơng pháp huyết thanh học
Là phƣơng pháp sử dụng rộng rãi, đặc hiệu và nhanh chóng để chẩn đoán virus thực vật.
Ba phƣơng pháp chính thử huyết thanh
- Phƣơng pháp kết tủa: Dựa trên cơ sở hỗn hợp virus và kháng huyết thanh, tạo sự kết tủa trong dung dịch hay trong gel
- Phƣơng pháp liên kết: Trong phƣơng pháp này virus tiểu thể hoặc kháng thể cho hấp thụ. Phản ứng dƣơng gây nên các tiểu thể lớn liên kết thành khối với nhau, tăng phản ứng virus-kháng thể.
+ ELISA: Thử nghiệm ELISA có nhiều dạng, tuy nhiên tất cả đều liên quan đến đĩa nhựa nhiều lỗ đã đƣợc xử lý đặc biệt, do đó bề mặt đĩa sẽ liên kết đƣợc với protein (virus hoặc kháng thể). Do tính đặc hiệu, kháng thể sẽ bắt các kháng nguyên đặc hiệu. Kế tiếp cho chất nền thích hợp vào thì màu sắc sẽ biến đổi nơi có kháng thể gắn với enzyme đƣợc giữ lại trên đĩa, nghĩa là có virus bệnh cần chẩn đoán.
+ DIBA hoặc FIPSA: Phân tích miễn dịch điểm giống nhƣ ELISA, nhƣng mẫu dịch cây đƣợc đƣa vào từng điểm trực tiếp trong màng nitrocellμlose hoặc nylon. Màng này liên kết tất cả protein bao gồm cả virus. Sau đó, sự có mặt của virus đƣợc xác định bằng kháng huyết thanh có gắn với enzyme.
2.2.3.5. Phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử
Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, từ năm 1980 các phƣơng pháp sinh học phân tử đã phát triển mạnh mẽ và mang lại nhiều thành tựu to lớn cho việc chẩn đoán, phát hiện và nghiên cứu bản chất virus gây bệnh nhƣ phƣơng pháp DNA probe, hybridation, PCR. Nhờ các phƣơng pháp này chỉ cần với một lƣợng nhỏ DNA hay RNA thu từ cây chủ, ta có thể khuếch đại chúng lên, qua bản gel điện di ta có thể xác định sự tồn tại của chúng.
2.2.3.6. Các phƣơng pháp khác (Vũ Khắc Nhƣợng, 1983)
Đối với một số loại bệnh cây còn dùng phƣơng pháp hóa học để chẩn đoán dựa vào sự xuất hiện màu sắc nhƣ dùng dung dịch CuSO4 3% để chẩn đoán bệnh virus Cucumis virus 2.
Phƣơng pháp huỳnh quang để chẩn đoán mô quả, hạt bị bệnh dựa vào đặc tính của mô bệnh và của kí sinh vật có khả năng phát sáng trong khi chiếu nguồn tia sáng có đủ độ dài sóng nhất định (nguồn sáng thƣờng dùng là đèn thạch anh).
Phƣơng pháp đo độ nhớt của dịch cây cũng là phƣơng pháp có thể dùng để chẩn đoán bệnh lý của một số trƣờng hợp cây bị bệnh.
2.2.4. Sơ lƣợc về phƣơng pháp ELISA- Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Phƣơng pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Phƣơng pháp này đƣợc thiết kế
cho việc phát hiện và định lƣợng vật chất nhƣ peptides, protein, antibodies, hormone,… Đôi khi nó còn đƣợc gọi bởi một tên gọi khác là EIA (Enzyme ImmunoAssay). Từ năm 1978, Clark và Adam đã ứng dụng phƣơng pháp ELISA trong chẩn đoán virus hại khoai tây, thí nghiệm này đã thành công và từ đó phƣơng pháp này đƣợc công nhận là có độ chính xác cao hơn các phƣơng pháp huyết thanh thông thƣờng và đƣợc ứng dụng nhiều trong chẩn đoán nhanh bệnh virus thực vật, phát hiện cây bệnh ẩn (Phạm Văn Ty, 2001).
Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác nhƣ nhau.
Cơ sở khoa học của phƣơng pháp này là: Khi có một protein lạ xâm nhập vào máu của động vật (kháng nguyên) thì trong cơ thể động vật sẽ có một phản ứng mạnh mẽ trở lại và sinh ra ở máu động vật một loại protein đặc hiệu (kháng thể). Kháng thể khi kết hợp với kháng nguyên sẽ tạo thành kết tủa, làm mất tác dụng của kháng nguyên, vô hiệu hóa kháng nguyên.
Trên cơ sở đó ngƣời ta đã tách virus từ cây bệnh, lấy virus đã đƣợc làm tinh khiết tiêm vào máu động vật làm thí nghiệm (thƣờng là thỏ, chuột bạch hay ngựa) để gây miễn dịch, sau đó thu đƣợc kháng huyết thanh đa dòng (polyclonal antibody). Bằng một số phƣơng pháp khác, ngƣời ta phân ly virus thành các dòng riêng biệt, thực hiện nhân chúng trên tế bào ung thƣ lách chuột bạch trong môi trƣờng vô trùng và thu đƣợc kháng huyết thanh đơn dòng (monoclonal antibody). Đặc điểm quan trọng của phản ứng kháng huyết thanh là tính đặc hiệu của nó: mỗi kháng nguyên chỉ kết hợp với một loại kháng thể tƣơng ứng mà thôi, không kết tủa chéo, do đó phƣơng pháp này đƣợc ứng dụng rất rộng rãi trong nghiên cứu khoa học và sản xuất.
Nhƣ vậy, kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu; thực hiện qua hai bƣớc:
- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể
- Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm.
Có 3 phƣơng pháp chính làm nền tảng cơ bản cho tất cả các dạng ELISA là (John R., 2001):
- Direct ELISA: Đây là dạng đơn giản nhất của phƣơng pháp ELISA. Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ đƣợc gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ đƣợc phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã đƣợc gắn enzyme).
- Indirect ELISA: Phƣơng pháp này khác Direct ELISA ở chỗ
kháng thể bắt kháng nguyên không đƣợc gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này mới là kháng thể đƣợc gắn với enzyme).
- Sandwich ELISA: Đây là một dạng ELISA đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng mạnh và nhạy. Đƣợc gọi là “sandwich” là do kết quả thí nghiệm đƣợc đánh giá thông qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies).
Kĩ thuật này cũng đƣợc phân làm hai dạng: Direct sandwich ELISA Indirect sandwich ELISA
Trong phạm vi đề tài khóa luận này, chúng tôi đã sử dụng kĩ thuật DAS ELISA (Double Antibody Sandwich) để thực hiện. Đây là một dạng của Direct sandwich ELISA với kháng thể sử dụng là kháng thể đa dòng thu nhận từ thỏ kể cả kháng thể bắt và kháng thể phát hiện.
Hình 2.8 Bộ test kit DAS ELISA
2.2.5. Sơ lƣợc về kĩ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction)
Kĩ thuật PCR (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998)
PCR (Polymerase Chain Reaction- phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) do Kary Mullis và cộng sự phát minh vào 1985. Đây là một công cụ khá mới trong
sinh học phân tử, đánh dấu một bƣớc tiến cực kì quan trọng và hiện đang đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong thực tiễn cũng nhƣ nghiên cứu. Thực chất nó là một phƣơng pháp tạo dòng in vitro, nghĩa là cũng nhằm mục đích thu nhận một một lƣợng lớn bản sao của một trình tự xác định.
Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR (Bùi Chí Bửu, 1999)
DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt.
Mồi (primer) là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Do đó nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đủ để thiết kế các mồi bổ sung chuyên biệt. Các mồi này bao gồm một mồi xuôi (sens primer hay forward primer) và một mồi ngƣợc (antisens primer hay reverse primer). Từ “xuôi” và “ngƣợc” phải hiểu là “xuôi” và “ngƣợc” so với chiều phiên mã của gen.
PCR đƣợc thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo 3 bƣớc sau: - Biến tính phân tử DNA (Denature)
- Sự bắt cặp giữa mồi và mạch khuôn (Annealing) - Tổng hợp mạch mới (Extension)
Ba bƣớc này hợp thành một chu kì và đƣợc lặp lại nhiều lần.
Những phản ứng này đƣợc thực hiện nhờ một enzyme polymerase chịu nhiệt (chẳng hạn nhƣ Taq polymerase) và sự thay đổi chu kì nhiệt hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho quá trình biến tính và bắt cặp.
Nested-PCR (Mc Pherson M.J., 2000)
Đây là một dạng cải tiến từ phƣơng pháp PCR, trong đó thí nghiệm sẽ đƣợc thực hiện lần lƣợt với hai hay nhiều cặp mồi. Cặp mồi thứ nhất sẽ khuếch đại trình tự có kích thƣớc lớn hơn, sau đó các mồi “nested” (nested primer) sẽ khuếch đại những đoạn nằm bên trong của sản phẩm PCR ban đầu bằng cách sử dụng sản phảm PCR đầu tiên này làm khuôn mẫu.
Phƣơng pháp nested-PCR cũng có thể thực hiện với một cặp mồi đầu tiên và một mồi đơn cho phản ứng nested-PCR sau đó. Phƣơng pháp này đƣợc gọi là Heminested- PCR (HN-PCR).
Với phƣơng pháp này, độ đặc hiệu của phản ứng tăng lên nhiều do mồi “nested” sẽ loại bỏ hầu nhƣ tất cả các sản phẩm không đặc hiệu của lần PCR đầu tiên. Song do sử dụng nhiều mồi nên độ nhạy của phản ứng cũng tăng lên, do đó phản ứng dễ nhiễm hơn so với PCR thông thƣờng. Vì vậy phải hết sức cẩn thận khi thao tác ở từng giai đoạn PCR .
RT-PCR (Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction)
Do Taq polymerase không hoạt động đƣợc trên RNA nên ngƣời ta sử dụng kĩ thuật phối hợp là RT-PCR (Reverse transcriptase- PCR).
Nguyên tắc của phƣơng pháp này là trƣớc tiên RNA sẽ đƣợc chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc. Mồi sử dụng cho phƣơng pháp này có thể là mồi “ngƣợc” của phản ứng PCR ở giai đoạn sau hoặc cũng có thể là oligonucleotide T (để bắt cặp với các đuôi poly A của các mRNA) mà cũng có thể là các mồi hexanucleotide (trình tự gồm 6 nucleotide) để bắt cặp với các trình tự ngắn trên RNA. Sau đó, cDNA sẽ đƣợc khuếch đại nhờ hoạt động của Taq polymerase. Ngoài ra, ngƣời ta cũng có thể sử dụng một enzyme chịu nhiệt khác là Tth polymerase. Sau khi tạo đƣợc nguồn cDNA từ mRNA, cDNA này sẽ đƣợc tiếp tục khuếch đại thông qua phản ứng PCR nhƣ trình bày ở phần trên.
Kĩ thuật RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lƣợng rất thấp không thể phát hiện bằng các phƣơng pháp thông thƣờng nhƣ Northern blot (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998).
PHẦN III
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3 năm 2005 đến tháng 8 năm 2005.
Địa điểm lấy mẫu: - Xã Mỹ Hiệp, xã Bình Thạnh, huyện Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp - Xã Phú Lộc, xã Phú An, huyện Tân Phú, tỉnh Đồng Nai
- Xã Phú Tân, huyện Định Quán, tỉnh Đồng Nai
Nơi thực hiện thí nghiệm: Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh- Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
3.2. Phƣơng pháp lấy mẫu
Do đu đủ ở các vƣờn đƣợc chọn chỉ là một loại cây trồng xen, bổ sung để tận dụng những khoảng đất trống khi cây trồng chính còn nhỏ, chƣa giao tán (nhƣ các vƣờn mãng cầu, cam quýt, bƣởi, xoài mới trồng) hoặc trồng thành đƣờng biên bao quanh các ruộng trồng cây ngắn ngày nhƣ đậu tƣơng, lạc nên chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu nhƣ sau:
- Trong các vƣờn trồng xen, thƣờng đu đủ đƣợc trồng thành hàng xen kẽ với cây trồng chính và các hàng đu đủ này cách nhau khoảng 2 - 4 m. Đối với những vƣờn này, lấy mẫu theo hình ziczắc sao cho việc lấy mẫu đảm bảo đƣợc tính chất ngẫu nhiên.
Đối với dạng trồng theo đƣờng biên của ruộng, nếu đƣờng biên này bao gồm nhiều hàng đu đủ hợp thành thì chúng tôi cũng tiến hành lấy mẫu theo đƣờng zic zắc; còn nếu đƣờng biên chỉ gồm một hàng đu đủ, lấy mẫu ngẫu nhiên theo khoảng cách (tức là cứ 5 - 10 cây thì lấy một mẫu).
- Trên mỗi cây đƣợc chọn, cắt lấy lá ở phần ngọn (cách đỉnh khoảng 2 - 3 lá) cho vào một bao nilon riêng có ghi nhãn cẩn thận với đầy đủ thông tin về địa điểm, chủ vƣờn, giống cây, triệu chứng, điều kiện canh tác (xem Bảng điều tra ở phần Phụ lục).
Mẫu sau đó đƣợc đem về phòng thí nghiệm và trữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ -20o C.
Bảng 3.1 Bảng thống kê số lƣợng mẫu lấy tại các địa điểm Stt Địa điểm Số lƣợng mẫu Tỉnh Huyện Xã 1 Đồng Tháp Cao Lãnh Mỹ Hiệp 45 Bình Thạnh 35 2 Đồng Nai Định Quán Phú Tân 20 Tân Phú Phú Lộc 20 Phú An 25 Tổng số mẫu 145
3.3. Phƣơng pháp giám định bệnh đốm vòng trên đu đủ (Papaya Ringspot Desease) Desease)
Trong phạm vi khóa luận tốt nghiệp này, tôi đã thực hiện giám định bệnh đốm vòng bằng phƣơng pháp DAS ELISA (Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay) và sau đó tiến hành kiểm tra lại kết quả của thí nghiệm ELISA bằng kĩ thuật RT-PCR trên các mẫu dƣơng tính thu đƣợc.
3.3.1. Dụng cụ và thiết bị Dụng cụ
- Cối, chày sứ dùng để nghiền mẫu - Kéo
- Cân phân tích
- Eppendoff 1,5 ml để chứa mẫu sau khi nghiền - Eppendoff 0,2 ml - Hộp đựng eppendoff - Micropipette P1000 - Micropipette P100 - Đầu tip 1000 μl - Đầu tip 100 μl
- Đĩa ELISA (microplates) 96 giếng và keo dán đĩa ELISA (adhesive film) - Ống đong
- Khay đổ gel điện di
- Bồn chứa Ethium bromide (nhuộm gel)
- Các dụng cụ cung cấp kèm theo kit ly trích RNA (nhƣ eppendoff, cột lọc, tube rửa…)
Máy móc, thiết bị
- Máy cất nƣớc 1 lần, 2 lần (Anh) - Máy li tâm (Sigma, Hettich)
- Tủ mát ( nhiệt độ 2 - 8oC), tủ lạnh -20oC và -80oC (trữ hóa chất và mẫu) (Reetech, Brandt, Sanyo)
- Tủ định ôn (cài đặt ở 37oC) (Memmert) - Bồn ủ nhiệt (Water bath) (Memmert) - Máy vortex (IKA Works)
- Máy luân nhiệt (máy thực hiện phản ứng PCR) (Ependof) - Lò viba (Electrolux)
- Bộ nguồn và bồn điện di (Biorad) - Máy đọc gel (Biorad)
3.3.2. Hóa chất
3.3.2.1. Dùng trong DAS ELISA
Sử dụng kit PLANTEST ELISA® trên đối tƣợng PRSV do hãng Bio Rad cung