Trong khi mẩu RNA chuẩn của virus gây bệnh PRRS dòng Olot/91 đã được phát hiện một cách ổn định dựa vào kỹ thuật RT-PCR một bước với cặp mồi của tác giả Rovira; quy trình ly trích đã được chứng minh cho hiệu quả cao trong việc ly trích RNA; mẫu xét nghiệm đã qua kiểm tra ELISA cho kết quả dương tính nhưng chúng tôi vẫn chưa phát hiện một mẫu nào có sự hiện diện của virus. Như vậy, bên cạnh việc nghi ngờ trong mẫu xét nghiệm không có sự tồn tại virus gây bệnh PRRS còn có thể do tính đặc hiệu của cặp mồi Rovira đang sử dụng. Do đó chúng tôi đã sử dụng chương trình Blast của trang web httt://www.ncbi.nlm.nih.gov/ để kiểm tra tính đặc hiệu của cặp primer này. Từ kết quả kiểm tra này cho thấy cặp primer của tác giả Rovira chỉ có khả năng khuếch đại đặc hiệu một loài duy nhất là Olot/91. Các loài khác thì tính đặc hiệu của cặp primer này là rất thấp. Trong khi dó cặp mồi P1, P2 của tác giả Meritxel Donadeu qua kiểm tra cho thấy có khả năng bắt cặp đặc hiệu với RNA của nhiều chủng virus PRRS khác nhau (xem phụ lục). Sử dụng cặp mồi P1, P2 như vậy sẽ làm tăng khả năng phát hiện virus PRRS trong mẫu.
4.5. RT - PCR sử dụng cặp primer p1, p2
Dựa vào kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của hai cặp primer, chúng tôi đã thử nghiệm việc sử dụng cặp primer P1, P2 trong phản ứng RT-PCR một bước đã được thiết kế ở trên để phát hiện virus PRRS trong mẫu huyết thanh ly trích (quy trình và thành phần hóa chất tham gia phản ứng giống như quy trình sử dụng cặp primer Rovira). Trong thí nghiệm này chúng tôi đã tiến hành RT-PCR trên một mẫu chuẩn và 5 mẫu ly trích RNA đã kiểm tra qua quy trình RT-PCR sử dụng cặp mồi theo tác giả Rovira cho kết quả âm tính để dễ dàng so sánh hai cặp primer. Kết quả của thí nghiệm được thể hiện trong hình 4.8.
Hình 4.6. Sản phẩm RT-PCR dùng cặp primerP1, P2 trên một mẫu RNA chuẩn và 5 mẫu huyết thanh ly trích theo quy trình dùng TRIzol.
Ghi chú: Giếng B12, 326, 160, 156, 62: Các mẫu ly trích theo TRIzol Giếng C: mẫu chuẩn Nồng độ gel: 1 %
Hiệu điện thế: 100V Thời gian điện di: 30 phút Như vậy kết quả trên hình 4.8 cho thấy mẫu RNA chuẩn có một băng rất đậm và rõ hơn nhiều so với khi sử dụng cặp mồi Rovira, thêm vào đó khi sử dụng cặp mồi P1, P2 không thấy xuất hiện băng phụ như thường thấy khi sử dụng cặp primer của tác giả Rovira. Điều này chứng tỏ độ nhạy và độ đặc hiệu của cặp primer P1, P2 là rất cao.
Các mẫu xét nghiệm đều không thấy có sự xuất hiện băng mong muốn. Do đó, dựa vào kết quả cuối cùng này và các kết quả thực hiện trong toàn quá trình thí nghiệm, chúng tôi có thể kết luận trong các mẫu ly trích không có sự hiện diện của virus gây bệnh PRRS.
62 156 B12 326 C 160
Phần V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Quy trình RT-PCR sử dụng trong nghiên cứu hoàn toàn cho phép phát hiện được RNA của virus PRRS.
Quy trình ly trích sử dụng TRIzol hoàn toàn có khả năng thu nhận RNA.
Quy trình điện di RNA tổng số có khả năng kiểm tra RNA tổng số sau quá trình ly trích.
Tất cả các mẫu đều không tồn tại virus PRRS ở thời điểm lấy mẫu. Sự hiện diện kháng thể kháng virus gây bệnh PRRS trong huyết thanh không đồng nghĩa với việc có sự hiện diện virus trong máu heo có kháng thể.
5.2. Đề nghị
Cần hoàn thiện hơn nữa quy trình ứng dụng RT-PCR trong việc phát hiện virus PRRS, khử băng phụ và giảm các thành phần phản ứng nhằm làm giảm giá thành cho một phản ứng xét nghiệm.
Thực hiện phản ứng RT-PCR phát hiện virus gây bệnh PRRS trên các mẫu mới lấy từ thú bệnh trong vòng 24 giờ.
Sử dụng song song các cặp mồi Rovira 1,2 và P1, P2 để thực hiện phản ứng RT- PCR phát hiện virus PRRS.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
1. Quách Tuyết Anh, 2003. Một số kinh nghiệm ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện
Mycoplasma hyopneumoniae trên mẫu bệnh tích phổi heo nhục hoá. Luận văn tốt
nghiệp. Khoa Chăn Nuôi Thú Y. Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
2. Phạm Sỹ Lăng, Nguyễn Thiện. Một số bệnh mới do virus ở gia súc và gia cầm nhập
nội và biện pháp phòng trị. NXB Nông Nghiệp, 2002.
3. Lê Quang Nguyên, 2003. Xây dựng quy trình phát hiện virus gây bệnh đầu vàng
YHV (Yellow Head Virus) trên tôm xú (Penaeus monodon) dựa trên phương pháp RT- PCR. Luận vặn tốt nghiệp. Khoa Sinh. Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP. Hồ
Chí Minh.
Tài liệu nƣớc ngoài
4. A. Rovira, M. Balasch, J. Segalés, L. Garcia, J. P;ana-durán, C. Rosell, H. Ellerbrok, A. Mankerz, and M.Domingo. 2002. Experimental inoculation of conventional pigs with porcine respiratory syndrome virus and porcine circovirus.
Journal of Virology. Vol.76, No. 7.
5. Brown T.A. Gene cloning an introduction. 3rd edition, UMIST, Manchester, UK. p. 229 – 249.
6. Chomzynski, P., and N. Sacchi. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate- phenol- chloroform extraction. Anal. Biochem. 162:156-159.
7. Christopher-Hennings J., E. A. Nelson, K. D. Rossow, J. L.Shivers, M. J. Yaeger, C. C. L. Chase, R.A. Gardano, J. E. collins và D. A. Benfield, 1998. Identification of porcine
reproduction and respiratory syndrome virus in semen and tissues from vasectomized and nonvasectormized boars. Vet. Pathol. 35: 260 – 267.
8. Donadeu M, Arias M, Gomez-Tejedor C, et al. Using polychainreaction to obtain PRRS-free piglets from endemically infected herd. Swine health prod. 1999; 7(6): 255-
261.
9. Fun In Wang, 1994. Minimal residues of porcine reproduction and respiratory syndrome virus in pig carcases and boar semen. Proc. Natl. Sci. counc. ROC(B).
Vol.33, No.4, 1994. PP. 167-174.
10. HorterC. D., Pogranicniy R. M., Cheng chang C., R. B.Evans, Kyong-Jin Yoon, J. J. Jimmerman, 2002. Characteration of the carrier State in Porcine reproduction and respiratory syndrom virus infection. Veterinary Microbiology. 86 (2002) p:213 – 218.
11. Meng X.J., Paul P.S., Halbur P.G., Lum M.A., 1995. Phylogenetic analysis of the putative M (ORF6) and N (ORF7) gene for porcine reproduction and respiratory syndrome virus (PRRSV): implication of the existense of two genotypes of PRRSV in the USA and Europe. Arch. Virol. 140: 745-55.
12. Prieto C., José M. Castro, 2005. Procine reproductive and respiratory syndrome virus infection in the boar: a review. Theriogenology. 63: 1-16.*
13. Sambrook and Russell. 2001. Molecule cloning a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. Vol 2. p8.47- 8.53.
14. Wagstrom E. A., Kyong- Jin Joon, and Jeffrey J Zimmerman,. Diagnostic performance of a RT-PCR test for the detection of porcine reproduction and respiratory syndrome in serum. Iowa State University. ADL-R1602.
Các trang web 15.http://www.ctu.edu.vn/institutes/farming/jircas/JIRCAS/research/workshop/pro03/ C9-Livestock %209 %20(Kamakawa).pdf 16. http://www.porkboard.org/docs/PRRSchapter7.pdf 17. http://www.porkboard.org/docs/PRRSchapter1.pdf 18.http://www.porkboard.org/docs/PRRSchapter2.pdf 19.http://www.porkboard.org/docs/PRRSchapter3.pdf 20.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi
PHỤ LỤC
Chuẩn bị môi trƣờng không có RNase và RNA
Khi làm việc với RNA, cần phải cẩn thận nhằm tạo ra một môi trường không có RNase. Ribonuclease tồn tại ở khắp nơi. RNase rất bền vững và khó bị bất hoạt. Để thành công, cần phải duy trì một môi trường không có RNase trước và trong khi thực hiện các thao tác tinh sạch và các phân tích sau đó. Sau đây là một số chú ý và kỹ thuật cần ghi nhớ khi làm việc với RNA:
1. Nguồn lây nhiễm RNA thông thường là RNA của da, vi khuẩn và nấm, chúng hiện diện rất nhiều trong bụi và trên các thiết bị. Để ngăn chặn sự nhiễm RNA cần phải mang găng tay trong suốt thời gian làm thí nghiệm và sử dụng các thiết bị vô trùng khi thực hiện các thao tác chiết tách hay phân tích.
2. Sử dụng các thiết bị vô trùng và chỉ sử dụng một lần. Những vật liệu này đòi hỏi phải sạch RNA.
3. Cần xử lý sạch RNA cho các dụng cụ trước khi thực hiện thao tác. Thông qua việc rửa các vật liệu bằng nhựa bằng 0.1N NaOH/1mM EDTA và sau đó với nước đã được xử lý với DEPC (Diethyl pyrocarbonate). Những công cụ này cần được sử lý sạch RNase bằng cách ngâm với nước DEPC 0.005% và gia nhiệt bằng cách sấy.
4. Nước cất hai lần khử ion cần được xử lý để đảm bảo không có sự hiện diện của RNase. Có thể kiểm tra điều này bằng cách ủ RNA trong nước mong muốn và sau đó kiểm tra bằng cách điện di.
5. Tất cả các dụng cụ và hoá chất thao tác trên RNA cần được dùng riêng.
6. Việc hấp riêng không có ý nghĩa để bất hoạt RNase. Tất cả các dung dịch trong phòng thí nghiệm đều cần phải được xử lý với DEPC 0.05% bằng cách ủ qua đêm. Tất cả các dịch trên cần phải được hấp trong 30 phút. Thêm nữa là không được sử dụng DEPC chung với những dung dịch đệm có Tris.
Duy trì điều kiện không có RNase trong phản ứng
Recombinant Rnasin(a,b) giúp giữ RNA không bị thoái hoá bằng cách ức chế một vài RNase mà không gây trở ngại cho các phản ứng về sau. Bảo vệ RNA trong phản ứng là một điều kiện cho sự thành công của thí nghiệm. RNase inhibitors là một công cụ rất mạnh trong việc duy trì một môi trường không có RNase. Để đảm bảo sự thành công RNase inhibitor cần không gây trở ngại cho các enzyme trong phản ứng. Rnasin® cần sử dụng với tỉ lệ 1:1 với RNase. Những kháng thể ức chế khác có lẽ hiện diện với một tỉ lệ quá nhỏ không đủ sức bảo vệ RNA trong phản ứng.
Chuẩn bị hóa chất cho điện diRNA
Deionize formamide: Cho Dowex® XG8 mixed-bed resin vào formamide và khuấy trộn trong nhiệt độ phòng trong khoảng 1 giờ. Sau đó lọc hai lần bằng giấy lọc Whatman®. Chia nhỏ ra và trữ lạnh ở -700C. 5X MOPS buffer - 10mM MOPS - 2,5 mM sobium acetate - 0,5 mM EDTA - pH 7.0
Ta tiến hành quá trình pha MOPS Buffer 5X như sau: + Chẩn bị chai khoảng 1lít
+ Cho vào đó 500 ml nước cất hai lần khử ion và đã được xử lý với DEPC. + Tiếp tục cho vào 12,5g MOPS
+ Tiếp tục cho vào 1,229g sodium acetate
+ Tiến hành lắc đều cho đến khi các hoá chất trong chai tan hết. + Tiếp tục cho vào chai 6ml EDTA (5,972ml)
+ Điều chỉnh đến pH = 7.0 với NaOH 10N
+ Tiếp tục cho nước cất hai lần khử Ion và đã được xử lý với DEPC vào để đạt thể tích là 600ml.
+ Chia nhỏ ra mỗi 200ml và tiến hành hấp khử trùng. Quá trình này có thể làm cho dung dịch buffer chuyển sang màu vàng nhưng điều này không ảnh hưởng đến chất lượng buffer.
Pha 500ml buffer điện di như sau
+ Chẩn bị 100ml 5X dung dịch MOPS + Cho thêm 2 ml formaldehyde 37 – 40%
+ Thêm nước đã khử DEPC cho đến khi đạt thể tích 500ml Chẩn bị buffer biến tính và đặt mẫu
Pha 1ml dung dịch 2X này như sau:
+ Cho 149,2 ml bromophenol blue 0,67% vào eppendorf 1,5 ml + Cho thêm 1,6 μl EDTA 1M
+ Thêm 80 μl glycerol 100% + Thêm 29,2 μl formol 37 – 40% + Thêm 121,2 μl formamide
+ Thêm 618,4 μl dung dịch MOPS 2,6 X
Quy trình ly trích RNA theo bộ kít QIAamp
Ổn định mẫu ở điều kiện nhiệt độ phòng (15 – 250
C) Ổn định buffer ở nhiệt độ phòng.
Kiểm tra buffer AW1 và AW2 đã pha và để ổn định ở nhiệt độ phòng.
Hoà tan lại khối kết tủa Buffer AVL/Carrier RNA bằng nhiệt nếu cần thiết và giữ ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
Tất cả các bước ly tâm đều thực hiện ở nhiệt độ phòng.
Bước 1: Cho 560 µl Buffer AVL có chứa Carrier RNA vào một tube 1.5 ml.
Bước 2: Cho 140 µl mẫu vào tube có chứa buffer ở trên. Vortex nhẹ để trộn đều trong 15 giây. Nếu mẫu cần phải rã đông thì chỉ nên rã đông một lần.
Bước 3: Ủ ở nhiệt độ phòng (15-250C) trong vòng 10 phút (thời gian hơi kéo dài hơn một chút).
Bước 4: Ly tâm nhẹ để mẫu dính bên trên rơi xuống.
Bước 5: Thêm 560 µl ethanol (96-100%), vortex nhẹ trong 15 giây, sau đó ly tâm nhẹ
để mẫu dính bên trên rơi xuống.
Bước 6: Hút 630µl dịch ở trên cho vào QIAamp spin column (trong một tube 2ml).
phút. Cho QIAamp spin column vào một tube 2 ml sạch và loại bỏ tube có chứa dịch lọc. (có thể ly tâm với tốc độ cao hơn ).
Bước 7: Mở QIAamp spin column và lặp lại bước 6.
Bước 8: Mở nắp QIAamp spin column một cách cẩn thận và thêm 500 µl Buffer AW1,
đóng nắp lại và tiến hành ly tâm với tốc độ 6000 x g (8000 vòng) trong 1 phút. Lấy
QIAamp spin column và cho vào một tube 2 ml mới. Bỏ tube có chứa dịch đi.
Bước 9: Mở nắp QIAamp spin column một cách cẩn thận, thêm 500 µl buffer AW2, đóng nắp lại và ly tâm với tốc độ 20000 x g (14000 vòng) trong 3 phút. Có thể thực
hiện ngay bước 10 hay thực hiện bước 9a.
Bước 9a: Chuyển QIAamp spin column vào một tube 2 ml mới, loại bỏ tube cũ có
chứa dịch lọc. Ly tâm với tốc độ 14000 vòng trong một phút.
Bước 10: Chuyển QIAamp spin column vào một tube ly tâm 1,5 ml mới. Loại bỏ tube
cũ có chứa dịch lọc. Cẩn thận mở nắp QIAamp spin column và thêm 60 µl AVE. Đóng nắp lại, giữ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Sau đó ly tâm với tốc độ 6000 x g (8000
vòng) trong 1 phút.
Bảng kết quả ELISA của một số mẫu huyết thanh
Mẫu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
S/P 0,4 0,64 0,54 1,05 1,44 1,13 0,72 0,46 0,54 1,04 0,41 Mẫu 12 13 14 15 16 17 18 19 10 21 22 S/P 0,5 0,88 1,18 1,41 0,64 0,62 0,3 0,89 1,24 1,13 0,24
Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu và độ nhạy của cặp primer Rovira dựa vào phần mềm Blast của trang web http://ncbi.nlm.nih.gov /
Sequences producing significant alignments: Score (Bits) E Value
gi|1061205|emb|X92942.1|PRRSENVNP Porcine reproductive and re... 48.1 0.002 gi|51094057|gb|AY588319.1| PRRSV LV4.2.1, complete genome 43.9 0.042 gi|21303335|gb|AY035944.1| Porcine reproductive and respirato... 43.9 0.042 gi|21303331|gb|AY035943.1| Porcine reproductive and respirato... 43.9 0.042 gi|21303327|gb|AY035942.1| Porcine reproductive and respirato... 43.9 0.042 gi|21303323|gb|AY035941.1| Porcine reproductive and respirato... 43.9 0.042 gi|2695776|emb|AJ223078.1|PRR223078 Porcine respiratory and r... 43.9 0.042 gi|30315358|gb|AF511526.1| Porcine respiratory and reproducti... 43.9 0.042 gi|30315355|gb|AF511525.1| Porcine respiratory and reproducti... 43.9 0.042 gi|10764661|gb|AF298882.1|AF298882 Porcine reproductive and r... 43.9 0.042 gi|63109378|gb|DQ009653.1| Porcine respiratory and reproducti... 43.9 0.042 gi|63109376|gb|DQ009652.1| Porcine respiratory and reproducti... 43.9 0.042 gi|63109374|gb|DQ009651.1| Porcine respiratory and reproducti... 43.9 0.042 gi|39980583|gb|AY395081.1| Porcine reproductive and respirato... 43.9 0.042 gi|39980575|gb|AY395080.1| Porcine reproductive and respirato... 43.9 0.042 gi|39980567|gb|AY395079.1| Porcine reproductive and respirato... 43.9 0.042 gi|11125727|gb|M96262.2|LEYPOLYENV Lelystad virus, complete geno 43.9 0.042 gi|294331|gb|L04493.1|PRWPOLGLYM Porcine reproductive and res... 43.9 0.042 gi|38146324|gb|AY366525.1| Porcine reproductive and respirato... 39.8 0.74
gi|30315361|gb|AF512378.1| Porcine respiratory and reproducti... 35.7 13
gi|1292880|emb|Z66548.1|PVLSOTKMO Puumala virus segment L, genom 35.7 13
gi|54111111|dbj|AB177636.1| D'Aguilar virus gene for outer ca... 35.7 13
gi|54111105|dbj|AB177633.1| Chuzan virus gene for outer capsi... 35.7 13
gi|54111101|dbj|AB177631.1| D'Aguilar virus gene for outer ca... 35.7 13
gi|54111099|dbj|AB177630.1| D'Aguilar virus gene for outer ca... 35.7 13
gi|49860681|gb|AY554397.1| Classical swine fever virus 96TD, com 33.6 55
gi|18482493|gb|AY072924.1| Classical swine fever virus isolat... 33.6 55
gi|42560487|gb|AY526727.1| Classical swine fever virus strain... 33.6 55
gi|42560485|gb|AY526726.1| Classical swine fever virus strain... 33.6 55
gi|49349068|gb|AF147806.2| Gallid herpesvirus 2, complete genome 31.5 231
Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu và độ nhạy của cặp primer P1, P2 dựa vào phần mềm Blast của trang web http://ncbi.nlm.nih.gov/
Sequences producing significant alignments: Score (Bits) E Value
gi|38385769|gb|AY457635.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020
gi|56111975|gb|AY656998.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020
gi|56111973|gb|AY656997.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020
gi|56111971|gb|AY656996.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020
gi|56111969|gb|AY656995.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020
gi|56111967|gb|AY656994.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020
gi|45827261|gb|AY569974.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020
gi|45827254|gb|AY569973.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020
gi|45827247|gb|AY569972.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020
gi|55792918|gb|AY796316.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020
gi|31747018|gb|AY262352.1| PRRSV HB-2(sh)/2002, complete genome 39.4 0.020
gi|61658265|gb|AY947888.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020
gi|61658263|gb|AY947887.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020
gi|61658259|gb|AY947885.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020