càng cao và do đú lượng enzyme được giữ lại càng nhiều, dẫn tới màu càng rừ, giỏ trị OD càng lớn. Ngược lại nếu trong mẫu khụng cú khỏng nguyờn (FSH) dẫn tới khụng cú khỏng thể gắn enzyme được giữ lại và do đú khụng cú màu và giỏ trị OD sẽ bằng giỏ trị OD của mẫu đối chứng trắng.
● Cỏc bước tiến hành - Chuẩn bị giếng
- Phủ bản bằng 50μl khỏng huyết thanh FSH (Hai bước trờn nhà sản xuất bộ Kits đó làm sẵn)
- Cho 50μl huyết thanh, sữa của bũ chậm động dục vào cỏc giếng - Đưa vào mỗi giếng 100 μl khỏng huyết thanh FSH cú gắn enzym - Đem ủ bản 30 phỳt ở nhiệt độ phũng
- Rửa loại bỏ dung dịch trong cỏc giếng - Rửa bản 3 lần bằng washing buffer;
- Đem ủ bản ở nhiệt độ phũng trong 10 phỳt; - Cho vào mỗi giếng 50 μl dừng phản ứng ;
- Đọc phản ứng bằng mỏy đo ELISA ở bước súng 450nm.
Lưu ý: vỡ thớ nghiệm đũi hỏi độ chớnh xỏc rất cao nờn mỗi mẫu cần lặp lại ớt nhất 2 lần (mỗi mẫu làm vào 2 giếng) theo hỡnh 3.1.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A S1 S1 1 1 9 9 17 17 25 25 33 33 B S2 S2 2 2 10 10 18 18 26 26 34 34 C S3 S3 3 3 11 11 19 19 27 27 35 35 D S4 S4 4 4 12 12 20 20 28 28 36 36 E S5 S5 5 5 13 13 21 21 29 29 37 37 F S6 S6 6 6 14 14 22 22 30 30 38 38 G H H 7 7 15 15 23 23 31 31 39 39 H L L 8 8 16 16 24 24 32 32 40 40
Hỡnh 3.1. Sơ đồ bố trớ mẫu vào cỏc giếng trong phản ứng ELISA
Ghi chỳ: Cỏc giếng nhựa ở cột dọc 1 và 2 chứa mẫu chuẩn để so sỏnh, trong đú:
S1 – S6: Dóy dung dịch FSH chuẩn cú nồng độ (mlU/ml) lần lượt FSH: 0, 5, 10, 25, 50, 100. (mlU/ml).
H: mẫu chuẩn cú nồng độ FSH cao L: mẫu chuẩn cú nồng độ FSH thấp
H và L luụn được đo ở mọi lần thớ nghiệm nhằm tớnh hệ số sai khỏc và độ lệch chuẩn giữa cỏc lần thớ nghiệm
- Cỏc giếng cũn lại cú số từ 1 đến 40 thuộc cỏc cột dọc từ 3 đến 12: là mẫu chứa FSH cần định lượng, mỗi mẫu 2 giếng đỏnh số thứ tự giống nhau.
Từ kết quả thu được ta tiến hành vẽ đường cong chuẩn biểu thị mối tương quan giữa mật độ quang học (Optical Density - OD) với nồng của dóy dung dịch chuẩn. Đường cong chuẩn FSH cú dạng như sau:
Hỡnh 3.2. Mối tương quan giữa mật độ quang học (OD) và nồng độ FSH (mlU/ml)
(đường chuẩn trờn được dựng theo chương trỡnh phần mềm TableCurve 2D phiờn bản số 4).
Đối chiếu kết quả về mật độ quang học với đường cong chuẩn biểu thị nồng độ FSH của dóy dung dịch chuẩn, ta xỏc định được nồng độ của FSH và trong mẫu cần định lượng.
* Định lượng Progesterone bằng phản ứng ELISA cạnh tranh
- Phương phỏp ELISA định lượng progesterone trong đề tài nghiờn cứu của chỳng tụi dựa trờn nguyờn lý của phản ứng cạnh tranh giỏn tiếp. Bộ Kits được mua của hóng Calbiotech của Mỹ.
● Nguyờn lý
- Cho lần lượt vào cỏc giếng nhựa đó được gắn trước khỏng khỏng thể đặc hiệu của progesterone.
+ Một lượng mẫu nhất định cú chứa progesterone cần chẩn đoỏn.
+ Một lượng nhất định dung dịch progesterone gắn enzyme (Horse Radish Peroxydase).
+ Một lượng khỏng thể đặc hiệu khỏng progesterone.
- Để cho quỏ trỡnh gắn giữa progesterone-khỏng thể-khỏng khỏng thể xẩy ra, người ta đem ủ giếng trong một thời gian nhất định sau đú đổ bỏ dung dịch trong giếng và rửa để loại bỏ phần khụng gắn.
- Cho cơ chất vào giếng và ủ lần thứ hai để tạo phản ứng cạnh tranh. Phản ứng cạnh tranh giữa cơ chất và enzyme sẽ tạo màu cho dung dịch.
Hỡnh ảnh cơ chế cạnh tranh trong phản ứng ELISA được mụ tả như trong hỡnh 3.3.
Hỡnh 3.3. Cơ chế trong phản ứng ELISA cạnh tranh (Henricks R.C, 1986 [45]) Khỏng khỏng thể Progesterone Khỏng thể khỏng Progesterone Progesterone (mẫu) Progesterone đó gắn enzyme Cơ chất 3 2 1
Căn cứ vào mức độ biểu hiện về màu của dung dịch cần định lượng so với màu của dóy dung dịch chuẩn, ngời ta cú thể nhận biết nồng độ progesterone thụng qua quan sỏt sự khỏc nhau về màu sắc của dung dịch trong giếng bằng mắt hoặc bằng mỏy so màu quang phổ.
Lượng progesterone gắn enzyme và lượng progesterone cú trong mẫu cần định lượng cú mối tương quan tỷ lệ nghịch khi cựng gắn khỏng thể trong giếng.
Nếu nồng độ progesterone trong mẫu cần phõn tớch càng cao thỡ càng cú ớt progesterone-enzyme được gắn vào khỏng thể trong giếng do đú màu của phản ứng khi cú cơ chất vào trong giếng sẽ nhạt thể hiện ở hỡnh 3.4.
Hỡnh 3.4. Trường hợp nồng độ progesterone trong mỏu cao
Nếu nồng độ progesterone trong mẫu cần phõn tớch thấp sẽ cú nhiều progesterone-enzyme được gắn vào khỏng thể trong giếng do đú màu của phản ứng khi cho cơ chất vào trong giếng sẽ sẫm màu thể hiện ở hỡnh 3.3
Mẫu
NỒNG ĐỘ PROGESTERONE TRONG MÁU CAO
Mẫu
HRA-P4
NỒNG ĐỘ PROGESTERONE
TRONG MÁU CAO
Nhạt màu
Rửa bỏ phần khụng gắn
Hỡnh 3.5. Trường hợp nồng độ progesterone trong mỏu thấp (Henricks R.C, 1986 [45])
● Cỏc bước tiến hành: - Chuẩn bị giếng
- Phủ bản bằng 10μl khỏng khỏng thể Progesterone và khỏng thể khỏng Progesterone (Hai bước trờn nhà sản xuất bộ Kits đó làm sẵn).
- Cho 10 μl huyết thanh, sữa của bũ chậm động dục vào cỏc giếng - Đưa vào mỗi giếng 100 μl Progesterone gắn enzym
- Đem ủ bản 60 phỳt ở nhiệt độ phũng - Rửa loại bỏ dung dịch trong cỏc giếng - Rửa bản 3 lần bằng washing buffer;
- Đưa vào mỗi giếng 100 μl dung dịch cơ chất TMB - Đem ủ bản ở nhiệt độ phũng trong 15 phỳt;
- Cho vào mỗi giếng 50 μl dừng phản ứng ;
- Đọc phản ứng bằng mỏy đo ELISA ở bước súng 450nm.
Cỏc mẫu được bố trớ trờn cỏc giếng tương tự như đó làm với FSH với dóy S1 – S6 là dóy dung dịch Progesterone chuẩn cú nồng độ (ηg/ml) lần lượt là: 0; 2,5; 5; 10; 20; 40 ηg/ml.
Mẫu Mẫu
HRA-P4
NỒNG ĐỘ PROGESTERONE TRONG MÁU THẤP
Sẫm m uà
Rửa bỏ phần khụng gắn
TMB (cơ chất) NỒNG ĐỘPROGESTERONETRONG MÁU
Hỡnh 3.6. Mối tương quan giữa mật độ quang học (OD) và nồng độ Progesterone (ηg/ml)
(Đường chuẩn trờn được dựng theo chương trỡnh phần mềm TableCurve 2D phiờn bản số 4).
Như vậy khỏc với FSH, kết quả của đường cong chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa mật độ quang học với nồng độ Progesterone sẽ là tỷ lệ nghịch. Nếu quan sỏt chung ta cú thể nhận thấy giếng nào càng nhạt màu thỡ nồng độ hormone trong mẫu càng cao.
3.3.3. Sử dụng hormone sinh dục và chế phẩm hormone để điều trị hiện tượng rối loạn quỏ trỡnh thụ tinh do nguyờn nhõn bệnh lý buồng trứng
* Sử dụng prostaglandin (PGF2α) để kớch thớch động dục.
PGF2α do hóng Intervet (Hà Lan) sản xuất, tiờm PGF2α cho bũ cú thể vàng tồn lưu. Trong thớ nghiệm, chỳng tụi chỉ tiờm PGF2α với những bũ mạnh khoẻ và khụng viờm đường sinh dục, mỗi liều 25 mg/con. Theo dừi động dục và phối giống trong thời gian từ 12 - 16 giờ kể từ khi bũ bắt đầu động dục, nếu khụng thấy động dục thỡ đến ngày thứ 11 tiờm tiếp 25 mg/con, tiếp tục theo dừi động dục và phối giống cho bũ trong khoảng 72 – 96 giờ, cho dự bũ cú động dục hay khụng. Tỷ lệ thụ thai được tớnh ở cả 2 chu kỳ (Tăng Xuõn Lưu và Cs, 2003 [22]).
Tiờm PGF2α Tiờm PGF2α Ngày
Ngày 1 11
* Sử dụng GnRH kết hợp với PGF2α trong trường hợp thiểu năng buồng trứng:
Đối với buồng trứng kộm phỏt triển và u nang buồng trứng, cú thể kết hợp thụt lugol 0,1 – 0,2% v à tiờm oxytoxin 40UI
Tiờm GnRH Tiờm PGF2α Tiờm GnRH
100 mg/con 25 mg/con 100 mg/con
Ngày 1 Ngày 7 Ngày 9
3.4. Phương phỏp xử lý số liệu
- Số liệu được xử lý trờn mỏy vi tớnh bằng phần mềm Excel theo phương phỏp thống kờ sinh vật học.
3.5. Thời gian và địa điểm nghiờn cứu
- Đề tài được nghiờn cứu trờn đàn bũ thuộc Nụng trường Phự Đổng và Trung tõm giống bũ và đồng cỏ Ba Vỡ – Hà Nội;
- Phũng cụng nghệ tế bào viện Cụng nghệ sinh học thuộc Trung tõm khoa học tự nhiờn và cụng nghệ Quốc gia.
- Thời gian nghiờn cứu từ 10/2008 – 10/2009.
3.6. Nguyờn liệu
- Mẫu huyết thanh bũ bỡnh thường và bũ bệnh lý - Kits chẩn đoỏn ELISA: FSH và Progesterone - Chế phẩm PGF2α và GnRH
4. KẾT QUẢ NGHIấN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả điều tra thực trạng khả năng sinh sản của đàn bũ lai hướng sữa ở Ba Vỡ – Hà Nội. sữa ở Ba Vỡ – Hà Nội.
Ngành chăn nuụi bũ sữa muốn phỏt triển thỡ việc khảo sỏt cỏc chỉ tiờu sinh sản là điều cần thiết. Bởi vỡ khả năng sinh sản của bũ sữa phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: yếu tố di truyền (giống), yếu tố mụi trường (thời tiết, khớ hậu) và cỏc yếu tố kỹ thuật (chăm súc, quản lý). Cụ thể khả năng sinh sản của quần thể bũ được thể hiện qua cỏc chỉ tiờu như: khối lượng cơ thể và tuổi phối giống lần đầu, khối lượng cơ thể và tuổi đẻ lần đầu, thời gian động dục lại sau đẻ, khoảng cỏch giữa hai lứa đẻ, hệ số phối giống và tỷ lệ thụ thai (Nguyễn Anh Cường, 1996 [6]).
Qua bảng 4.1 chỳng tụi thấy số bũ sinh sản ở cả Trung Tõm nghiờn cứu Bũ và Đồng cỏ Ba Vỡ và Nụng trường Phự Đổng đều chiếm tỷ lệ rất cao, cụ thể là 344 con chiếm tỷ lệ 55,04% (Trung tõm Ba Vỡ) và 350 con chiếm tỷ lệ 77,78% (Nụng trường Phự Đổng).
Cũng qua bảng 4.1 thấy rằng cú sự chuyển dịch về đàn bũ lai hướng sữa F2 so với F1 đặc biệt là ở Nụng trường Phự Đổng F2 là 350 con chiếm tỷ lệ 77,78% so với tổng đàn là 450 con.
Bảng 4.1. Cơ cấu đàn bũ sữa của Trung tõm nghiờn cứu bũ và đồng cỏ Ba Vỡ Địa điểm Số lượng (con) Tỷ lệ (%) Bờ 0 - 6
thỏng tuổi Bũ hậu bị Sinh sản
Số lượng (con) (Tỷ lệ %) Số lượng (con) (Tỷ lệ %) Số lượng (con) (Tỷ lệ %) Ba Vỡ F1 270 43,20 82 (30,37) 57 (21,11) 131 (48,52) F2 355 56,80 78 (21,97) 64 (18,03) 213 (60,00) Σ 625 100 160 (25,60) 121 (19,36) 344 (55,04) Phự Đổng F1 100 22,22 12 (12,0) 7 (7,0) 81 (81,00) F2 350 77,78 48 (13,71) 33 (9,43) 269 (76,86) Σ 450 100 60 (13,33) 40 (8,89) 350 (77,78)
4.1.1. Tuổi phối giống lần đầu và khối lượng cơ thể của đàn bũ lai hướng sữa
Qua theo dừi và điều tra đàn bũ trờn địa bàn Ba Vỡ và Nụng trường Phự Đổng – Gia Lõm, chỳng tụi xỏc định được tuổi phối giống lần đầu. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.2.
Tuổi phối giống lần đầu là một trong những chỉ tiờu quan trọng phản ỏnh khả năng sinh sản của từng cỏ thể. Nhiều tỏc giả cho rằng tuổi phối giống lần đầu thớch hợp cho bũ sữa là 16 – 18 thỏng tuổi, khi đú trọng lượng của bũ sữa đạt 65 – 70% khối lượng lỳc trưởng thành. Từ đú chỳng tụi đó xỏc định tuổi phối giống lần đầu của đàn bũ lai hướng sữa nuụi tại Ba Vỡ trung bỡnh là 20,04 (thỏng) ở nhúm F1, 20,18 (thỏng) ở nhúm F2. Cao nhất ở đàn bũ F2 nuụi ở Nụng trường Phự Đổng là 21,91 (thỏng) và thấp nhất ở đàn bũ nhúm F1 được nuụi ở Trung tõm Ba Vỡ là: 20,04 (thỏng).
Ba Vỡ ở nhúm F1 là 282,91 (kg), ở nhúm F2 là 292,68 (kg). Khối lượng cơ thể khi phối giống lần đầu của hai nhúm bũ F1 và F2 ở Nụng trường Phự Đổng lần lượt là 291,31 (kg), 299,61 (kg) cú sự khỏc nhau rừ rệt. Qua đú, chỳng tụi nhận thấy tuổi phối giống lần dầu ở khu vực Phự Đổng cao hơn sơ với khu vực Ba Vỡ. Nguyờn nhõn chủ yếu do tuổi động dục lần đầu ở Ba Vỡ thấp hơn và thành thục về tớnh đến sớm hơn so với bũ ở khu vực Phự Đổng.
Sự sai khỏc về tuổi phối giống lần đầu ở hai đàn bũ núi trờn cú thể là do nguyờn nhõn về điều kiện chăm súc nuụi dưỡng đàn bờ từ 0 - 18 thỏng khỏc nhau gõy nờn. Theo Nguyễn Trọng Tiến (1991) [36] mức độ dinh dưỡng thấp sẽ kỡm hóm sự sinh trưởng của cơ thể. Sự cũi cọc thường đi kốm với sự thành thục tớnh dục chậm chạp. Khối lượng cơ thể của trõu bũ lớn, vỡ thế phải đạt được một số tớch luỹ nhất định về khối lượng mới sảy ra động dục lần đầu. Theo Lờ Xuõn Cương (1997) [5] tuổi phối giống lần đầu của đàn bũ lai F1 ở miền Nam là 19,1 ± 0,07 (thỏng). Tỏc giả Tăng Xuõn Lưu và Cs (2001) [21] cho biết tuổi phối giống của đàn bũ nuụi trong những năm trước đõy trung bỡnh là 26,9 (thỏng). Theo Nguyễn Xuõn Trạch và Cs (2004) [36], tuổi phối giống lần đầu ở khu vực Hà Nội là 18,7 thỏng tuổi.
Khi nghiờn cứu trờn đàn bũ lai hướng sữa đại trà tại Ba Vỡ nuụi thớ nghiệm lụ bờ từ 7 - 24 thỏng tuổi nhúm F1 cú tuổi phối lần đầu là 19,06 ± 1,14 thỏng (Nguyễn Kim Ninh, 1994) [24], tuổi phối giống lần đầu ở bũ vàng Việt Nam là 22,5 thỏng (Lờ Xuõn Cương, 1993 [4]). Theo Chămberlain (1992) [41] tuổi động dục lần đầu của cỏc giống bũ Shorthorn, Africauder, Friesian, Terney ở Nam Phi là 13,8 thỏng với chế độ nuụi dưỡng tốt cũn ở chế độ nuụi dưỡng kộm là 21,1 thỏng.
Như vậy tuổi phối giống lần đầu ở đàn bũ lai hướng sữa nuụi tại Trung tõm Ba Vỡ và Nụng trường Phự Đổng cú sự rỳt ngắn hơn so với đàn bũ lai hướng sữa được nuụi cựng khu vực cỏc năm trước đõy và sự sai khỏc của cỏc vựng là khụng đỏng kể.
Bảng 4.2. Tuổi phối giống lần đầu và khối lượng cơ thể của bũ cỏi lai hướng sữa nuụi tại Ba Vỡ và Nụng trường Phự Đổng Địa điểm Giống F1 Giống F2 n Tuổi (thỏng)
Khối lượng cơ thể
(kg) n
Tuổi (thỏng)
Khối lượng cơ thể (kg) x m X± Phạm vi biến động X±mx Cv% X±mx Phạm vi biến động X±mx Cv% Trung tõm Ba Vỡ 38 20,04± 0,65 13 - 30 282,91±0,96 2,10 38 20,18±0,57 15 - 39 292,68±1,39 2,94 Nụng trường Phự Đổng 30 21,33± 0,71 14 - 28 291,31±2,26 2,26 30 21,91±0,98 16 - 36 299,61±2,82 5,17 Trung bỡnh 68 20,61±0,48 13 - 30 286,62±1,24 3,56 68 20,94±0,55 15 - 39 295,74±1,60 4,51
4.1.2.Tuổi đẻ lứa đầu và khối lượng cơ thể của đàn bũ cỏi lai hướng sữa
Tuổi đẻ lứa đầu và khối lượng cơ thể khi đẻ lứa đầu của đàn bũ lai hướng sữa tại Ba Vỡ và Nụng trường Phự Đổng được trỡnh bày ở bảng 4.3.
Qua điều tra chỳng tụi cú kết quả ở bảng 4.3 cho thấy, bũ F1 đẻ lứa đầu trung bỡnh 29,9 (thỏng), bũ F2 đẻ lứa đầu vào khoảng 31,43 (thỏng), với khối lượng cơ thể tương ứng là: 325,21(kg), 336,46(kg). Theo Nguyễn Kim Ninh và Cs (1994) [24] nghiờn cứu trờn bũ F1 và F2 của Trung tõm nghiờn cứu bũ và đồng cỏ Ba Vỡ cho biết tuổi đẻ lứa đầu của nhúm bũ F1 là 32,1 (thỏng) và bũ F2 là 30,8 (thỏng). Kết quả nghiờn cứu của Tăng Xuõn Lưu (1999) [20] trờn đàn bũ sữa tại Trung tõm thỡ tuổi đẻ lứa đầu của đàn bũ F1 trung bỡnh là 38,47 (thỏng), F2 trung bỡnh là 38,87 (thỏng), cao hơn khỏ nhiều so với kết quả khảo sỏt của chỳng tụi. Kết quả nghiờn cứu của Lờ Viết Ly và Cs (1997) [19] thỡ tuổi đẻ lứa đầu của đàn bũ 36,6 (thỏng). Trịnh Quang Phong (1996) [26] nghiờn cứu trờn đàn bũ F2 cú tuổi đẻ lứa đầu là 46,48 (thỏng), Nguyễn Quốc Đạt (1998) [11] cho biết tuổi đẻ lứa đầu trung bỡnh ở đàn bũ sữa lai nuụi ở cỏc hộ gia đỡnh tại thành phố Hồ Chớ Minh trung bỡnh là 26,88 thỏng; F1 là 26,27 thỏng; F2 là 27,17 thỏng và thấp nhất ở F3 là 26,63 thỏng.
Theo nhiều tỏc giả thỡ tuổi đẻ lứa đầu phụ thuộc rất nhiều vào chế độ chăm súc nuụi dưỡng. Thớ nghiệm của Chamberlain A (1992) [41] khi nuụi bũ sữa trờn hai mức độ dinh dưỡng tốt và kộm đó chỉ ra: tuổi đẻ lứa đầu bỡnh quõn ở chế độ dinh dưỡng kộm kộo dài hơn 9 – 10 thỏng so với chế độ dinh dưỡng tốt.
Nhưng khi nuụi dưỡng kộm, khụng đủ dinh dưỡng, cú tuổi đẻ lứa đầu tương ứng bỡnh quõn tương ứng là 41,1; 41,41 và 33 thỏng.
Ở Mộc Chõu và thành phố Hồ Chớ Minh do chế độ dinh dưỡng tốt hơn (đặc biệt