D-loop là vùng không mã hóa duy nhất trên DNA ty thể ở động vật có xƣơng sống. Vùng này chứa điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nặng và các promoter phiên mã của DNA ty thể. Với đặc trƣng tích luỹ các đột biến cao gấp 5 - 10 lần so với các gen khác trong ty thể và so với DNA nhân, D-loop trở thành vùng có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu đa dạng sinh học và sự phát sinh chủng loại của sinh vật. Chính vì thế, nhằm mục đích đánh giá tính đa dạng di truyền của các cá thể gà thuộc 3 giống Ri, Đông Tảo và Tre, chúng tôi chọn trình tự nucleotide của vùng D-loop hệ gen ty thể làm đối tƣợng nghiên cứu.
Nhân gen bằng kỹ thuật PCR thành công khi phản ứng có tính đặc hiệu cao. Do đó, để cho ra sản phẩm tốt nhất thì điều kiện phản ứng phải đƣợc tối ƣu hóa. Để nhân vùng D-loop cần có DNA khuôn, mồi, các dNTP, Taq DNA polymerase, MgCl2, dung dịch đệm và một chu trình nhiệt thích hợp.
* Thành phần của phản ứng PCR
- Dung dịch đệm (Buffer): phản ứng PCR đƣợc thực hiện trong môi trƣờng đệm có pH 7,2 để ổn định hoạt động của Taq polymerase. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng loại đệm có chứa NH4+
nhƣng không chứa Mg2+ của hãng Fermentas, đệm này phù hợp cho hoạt động của Taq
polymerase và khoảng biến thiên rộng về nồng độ của MgCl2. Hơn nữa, loại đệm này cho chất lƣợng sản phẩm tốt hơn so với loại đệm không chứa NH4+
. - Nồng độ Mg2+: trong các thí nghiệm, chúng tôi sử dụng đệm không chứa Mg2+
để có thể khảo sát mức độ ảnh hƣởng của nó tới phản ứng. Nồng độ ion Mg2+
(đƣợc cung cấp dƣới dạng MgCl2) có thể ảnh hƣởng tới nhiệt độ biến tính (Tm) của DNA khuôn, hoạt tính của Taq polymerase và độ chính
xác của kết quả. Nồng độ Mg2+
quá cao sẽ làm tăng sự ổn định của DNA sợi đôi và ngăn cản sự biến tính hoàn toàn để giải phóng sợi đơn trong mỗi chu kỳ PCR làm cho sản phẩm PCR nghèo đi, nó còn làm tăng hiện tƣợng bắt cặp giả tại những vị trí không tƣơng đồng dẫn đến xuất hiện các sản phẩm không đặc hiệu. Ngƣợc lại, nếu nồng độ Mg2+
quá thấp sẽ ảnh hƣởng xấu đến quá trình tổng hợp DNA vì Mg2+
đóng vai trò là một co-factor của Taq
polymerase. Do đó, cần phải xác định nồng độ tối ƣu của Mg2+ nhằm đảm bảo hiệu suất khuếch đại và tính đặc hiệu của sản phẩm PCR. Sau khi khảo sát một số nồng độ Mg2+
khác nhau, chúng tôi nhận thấy nồng độ Mg2+ 10 mM thích hợp nhất cho việc khuếch đại vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR.
- dNTPs: hàm lƣợng của các dNTP thích hợp sẽ cho kết quả ổn định, chính xác và đặc hiệu. Bốn loại dNTP cần đƣợc sử dụng với nồng độ tƣơng đƣơng nhau để giảm thiểu tối đa hiện tƣợng kết hợp sai (misincorporation) mã di truyền nào đó. Nồng độ cao dNTP không tốt cho phản ứng vì nó sẽ cô lập ion Mg2+. Nồng độ của mỗi loại dNTP còn phụ thuộc vào kích thƣớc của đoạn DNA cần nhân lên. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng nồng độ dNTPs 10 mM (0,25 mM mỗi loại).
- Cặp mồi sử dụng để nhân bản vùng D-loop:
Chúng tôi tiến hành PCR với việc sử dụng cặp mồi H1255 và L16725 [9], [22], [25], [30], [36] để nhân vùng D-loop từ các mẫu DNA tổng số đƣợc cung cấp. Các thông tin về cặp mồi này nhƣ sau:
H1255 (Tm = 55oC): 5’ - CAT CTT GGC ATC TTC AGT GCC - 3’ L16725 (Tm = 60oC): 5’ - AGG ACT ACG GCT TGA AAG C - 3’ Ở đây, H (Heavy chain) và L (Light chain) là ký hiệu chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, còn chữ số là số chỉ vị trí nucleotide đầu 3' của mồi trong trình tự đầy đủ của mtDNA ở gà [22].
H1255 và L16725 là cặp mồi bảo thủ, đƣợc thiết kế dựa trên trình tự hai đầu vùng D-loop ở gà nhà do đó có thể sử dụng cho nhiều loài, giống khác nhau trong bộ Gà (Galliformes) [9]. Theo lý thuyết, sản phẩm thu đƣợc khi nhân bản bằng cặp mồi trên có chiều dài khoảng 1,3 kb.
Việc điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi và nồng độ mồi quyết định lƣợng sản phẩm thu đƣợc. Hai mồi H và L phải có nồng độ bằng nhau và phải đƣợc điều chỉnh thích hợp sao cho không quá cao để tránh hiện tƣợng primer-dimer và hiện tƣợng các mồi gắn nhầm vị trí trên khuôn mẫu, nồng độ mồi cũng không đƣợc quá thấp để tránh làm giảm lƣợng sản phẩm tạo thành. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng mồi có nồng độ 10 pmol/ l đối với mỗi loại H và L.
- Nồng độ DNA khuôn: PCR gồm hai giai đoạn: giai đoạn sàng lọc và giai đoạn khuếch đại. Nếu các chất trong thành phần phản ứng (bao gồm mồi) có nồng độ cao trong khi DNA khuôn lại có nồng độ thấp thì giai đoạn sàng lọc của PCR sẽ trở nên khó khăn hơn vì tần suất để mồi và DNA khuôn gặp nhau giảm rõ rệt, trong khi sự tiếp xúc giữa mồi với mồi lại tăng lên gây ra hiện tƣợng primer-dimer trong giai đoạn khuếch đại. Thông thƣờng, nồng độ DNA khuôn mẫu đƣợc sử dụng trong khoảng từ 10 - 100 ng/ 25 µl dung dịch phản ứng. DNA khuôn sử dụng trong đề tài là 71 mẫu DNA tổng số của 3 giống gà: Ri, Đông Tảo và Tre, các mẫu này có độ tinh sạch cao và ít bị đứt gãy.
- Taq polymerase: nồng độ enzyme quá cao có thể làm xuất hiện các sản phẩm PCR không đặc hiệu dẫn tới sai lệch kết quả. Ngƣợc lại, nếu nồng độ enzyme quá thấp sẽ không đủ để xúc tác tạo ra đủ lƣợng sản phẩm mong muốn. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng enzyme Taq polymerase nồng độ 5 unit/ l.
Thành phần phản ứng khuếch đại đoạn DNA cho một mẫu với tổng thể tích 25 l nhƣ trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thành phần phản ứng khuếch đại DNA Thành phần Nồng độ Thể tích (l) Buffer 10 X 2,5 MgCl2 10 mM 2,5 dNTPs 10 mM 2,5 Mồi H1255 10 pmol/ l 1 Mồi L16725 10 pmol/ l 1
Taq DNA polymerase 5 unit/ l 0,2
DNA khuôn 15 ng x
H2O - y
Tổng thể tích 25
* Chu trình nhiệt của PCR:
PCR là loại phản ứng đòi hỏi sự chính xác về chu trình nhiệt của phản ứng cũng nhƣ thành phần và nồng độ các chất tham gia. Tổng số chu kỳ chúng tôi tiến hành là 35, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn chính nhƣ sau:
- Giai đoạn biến tính: nhiệt độ biến tính thƣờng khoảng 94 - 95oC để đảm bảo sau khoảng 30 chu kỳ PCR, Taq DNA polymerase vẫn giữ đƣợc hoạt tính. Thời gian biến tính tuỳ thuộc vào hàm lƣợng G - C và chiều dài phân tử DNA. Chúng tôi chọn nhiệt độ biến tính là 940, thời gian 1 phút.
- Giai đoạn gắn mồi: điều quan trọng nhất khi thực hiện phản ứng PCR là việc lựa chọn và tìm ra nhiệt độ gắn mồi thích hợp. Nhiệt độ gắn mồi phải thấp hơn Tm của cặp mồi sử dụng để cho mồi có thể bắt cặp tốt với DNA khuôn. Vì Tm nhỏ nhất của cặp mồi trên là 55oC nên chúng tôi đã tiến hành thử chạy phản ứng ở một số giá trị khác nhau trong khoảng nhiệt độ từ 50 -
54oC, qua đó chọn đƣợc nhiệt độ gắn mồi tối ƣu trong thí nghiệm này là 54o C. Thời gian của giai đoạn gắn mồi là 1 phút 10 giây.
- Giai đoạn kéo dài chuỗi: nhiệt độ lúc này đƣợc tăng đến 72oC để cho enzyme Taq polymerase hoạt động tốt nhất. Trình tự vùng D-loop quan tâm có kích thƣớc 1227 bp trong khi tốc độ tổng hợp của phản ứng vào khoảng 1000 nucleotide/ phút nên thời gian của giai đoạn này là 1 phút 20 giây.
Bảng 3.2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Các bƣớc Khởi động nóng Biến tính Gắn mồi Kéo dài Ổn định Giữ mẫu Nhiệt độ 94oC 94 oC 54 oC 72 oC 72 oC 4 oC Thời gian 4’ 1’ 1’10’’ 1’20’’ 10’ Số chu kỳ 1 35 1 1
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% (Hình 3.1) cho thấy các băng DNA đều sáng đậm, rõ nét, tập trung ở vị trí giữa băng 1,5 kb và 1 kb, nhƣ vậy sản phẩm PCR có kích thƣớc phân tử vào khoảng 1,3 kb, phù hợp với tính toán lý thuyết khi thiết kế mồi. Do đó, có thể sơ bộ kết luận đây là vùng D-loop của hệ gen ty thể gà.
Hình 3.1. Ảnh điện di sản phẩm PCR của một số mẫu gà nghiên cứu
Dt: gà Đông Tảo, Ri: gà Ri, Tr: gà Tre
M Dt01 Dt05 Dt09 Dt17 Ri03 Ri07 Ri14 Ri21 Tr06 Tr11 Tr18
1,5 1 Kb