Các số liệu PCR - RAPD được xử lý và phân tích trong chương trình NTSYSpc version 2.0 nhằm tìm ra khoảng cách di truyền giữa các mẫu dẻ nghiên cứu thông qua hệ số tương đồng di truyền và biểu đồ hình cây.
Để kiểm tra phương pháp phân nhóm, chúng tôi đã tiến hành xác định giá trị tương quan kiểu hình theo ba phương pháp tính hệ số di truyền giống nhau (phương pháp của Jaccard, của Nei & Li, của Sokal) với bốn kiểu phân nhóm (WPGMA, UPGMA, liên kết hoàn toàn và liên kết đơn lẻ) (bảng 3.4). Biểu đồ hình cây được thiết lập dựa trên giá trị tương quan cao nhất với các giá trị khi r 0,9: tương quan rất chặt, r = 0,8 - 0,9: tương quan chặt, r = 0,7 - 0,8: tương quan tương đối chặt, r 0,7: tương quan không chặt.
Bảng 3.4 cho thấy, với ba cách tính hệ số di truyền giống nhau và bốn kiểu phân nhóm phản ánh mối tương quan kiểu hình của 5 mẫu dẻ dao động rất chặt 0,99878 - 0,99943. Trong đó, giá trị tương quan kiểu hình (r) lớn nhất 0,99943 khi tính theo hệ số di truyển Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA. Vì vậy, sơ đồ hình cây được thiết lập theo hệ số di truyền giống nhau Jaccard và
Bảng 3.4. Giá trị tương quan kiểu hình (r) theo 3 cách tính về hệ số tương đồng
Phương pháp
Kiểu phân nhóm UPGMA WPGMA Liên kết
hoàn toàn Liên kết đơn lẻ SM 0,99911 0,99911 0,99911 0,99911 Dice 0,99879 0,99879 0,99879 0,99878 Jaccard 0,99943 0,99910 0,99910 0,99909
Kết quả bảng 3.5 cho thấy, 3 mẫu dẻ TK1, TK2 và TK3 thu ở các khu vực khác nhau ở huyện Trùng Khánh - Cao Bằng có mức độ tương đồng đạt 100% khi phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên. Điều này cho thấy, các mẫu dẻ TK có độ thuần và độ đồng nhất rất cao.
Bảng 3.5. Hệ số tương đồng giữa các mẫu dẻ nghiên cứu
TK1 TK2 TK3 BG TQ TK1 1,00000 TK2 1,00000 1,00000 TK3 1,00000 1,00000 1,00000 BG 0,69565 0,69565 0,69565 1,00000 TQ 1,00000 1,00000 1,00000 0,69565 1,00000
Kết quả ở bảng 3.5 cũng cho thấy mức độ gần gũi di truyền của các mẫu dẻ Trùng Khánh và Trung Quốc. Bốn mẫu TK1, TK2, TK3 và TQ không xuất hiện sự khác biệt. Các phân đoạn DNA được nhân lên của bốn mẫu trên với các mồi nghiên cứu không có sự sai khác. Mẫu dẻ Bắc Giang có mức độ tương đồng DNA thấp so với các mẫu dẻ từ Vân Nam - Trung Quốc và Trùng Khánh - Cao Bằng. Hệ số tương đồng giữa mẫu dẻ Bắc Giang với các mẫu còn lại đạt 69,6% (sai khác tới 30,4%). Sự sai khác DNA của mẫu dẻ Bắc
Giang so với các mẫu còn lại nhận biết được do sự xuất hiện hay không xuất hiện phân đoạn DNA được nhân bản ở những kích thước nhất định.
Quan hệ di truyền của các mẫu dẻ nghiên cứu được thể hiện trên sơ đồ hình cây (hình 3.4) và được chia thành 2 nhánh:
- Nhánh I: Bao gồm duy nhất mẫu dẻ Bắc Giang, có sự sai khác so với 4 mẫu còn lại tới 30,4% (1- 0,696).
- Nhánh II: Bao gồm 4 mẫu dẻ TK1, TK2, TK3 và TQ. Các mẫu này không có sự sai khác di truyền. Như vậy, có thể nói 3 mẫu dẻ thu thập từ các vùng khác nhau ở Trùng Khánh - Cao Bằng và mẫu dẻ Vân Nam - Trung Quốc thuộc cùng 1 loài.
Kết quả này hoàn toàn phù hợp với hệ thống phân loại thực vật theo NguyễnTiến Bân (2003) [4]. Các mẫu dẻ Trùng Khánh và dẻ thu từ Vân Nam - Trung Quốc thuộc cùng loài Castanea molissima Blum (dẻ Trùng Khánh, dẻ Cao Bằng, dẻ Pố Tấu) thuộc chi CASTANEA Mill.1754 (Dẻ Trùng Khánh). Mẫu dẻ thu từ Bắc Giang thuộc loài Castanopsis boisii Hickel & Camus, 1992 (dẻ gai Yên Thế, dẻ gai Bắc Giang) trong chi CASTANOPSIS (D. Don) Spach, 1841, nom. Cons. (Dẻ gai, Cà ổi, Kha thụ) [4].
Nhánh II
Nhánh I
Hình 3.4. Biểu đồ hình cây các mẫu dẻ nghiên cứu theo hệ số của Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA
3.2. Kết quả nhân giống vô tính dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật
3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của cồn 70o và javen 65% đến khử trùng hạt trùng hạt
Dựa trên công thức khử trùng của một số cây , chúng tôi thử tìm môi trường và điề u kiện khử trùng thích hợp cho hạt dẻ Trùng Khánh . Hạt dẻ Trùng Khánh sau khi bóc hết 2 lớp vỏ cứng và vỏ gai được đem khử trùng trong cồn 70o
và javen 65% với các ngưỡng thời gian khác nhau. Hạt dẻ đã khử trùng được cấy vào môi trường WPM cơ bản, bổ sung nước dừa 200ml/l. Kết quả sau 4 tuần theo dõi được trình bày trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả khử trùng hạt dẻ Trùng Khánh Công thức Thời gian (phút) Tỉ lệ hạt sống không nhiễm (%) Tỉ lệ hạt nhiễm (%) Tỉ lệ hạt chết (%) Cồn 70o Javen 65% 1 2 25 31,67 55,00 13,33 2 5 25 35,00 46,67 18,33 3 7 25 63,33 20,00 16,67 4 10 25 55,00 21,67 23,33 5 2 20 28,33 56,67 15,00 6 5 20 30,00 58,33 11,67 7 7 20 25,00 56,67 18,33 8 10 20 26,67 35,00 38,33
Kết quả bảng 3.6 cho thấy, các công thức 4 và 8 có tỉ lệ hạt nhiễm thấp (dao động từ 21,67% đến 35%) nhưng tỉ lệ hạt chết lại khá cao (23,33% - 38,33%). Công thức 1, 2, 5, 6 cho tỉ lệ hạt chết thấp (từ 13,33% - 18,33%) nhưng tỉ lệ nhiễm lại khá cao (dao động từ 46,67% đến 58,33%). Ở công thức 7, tỉ lệ hạt nhiễm và chết đều cao nên tỉ lệ hạt sống không nhiễm thấp (25,00%) Hạt dẻ được khử trùng với cồn 70o
25 phút có tỉ lệ hạt nhiễm (20,00%) và tỉ lệ hạt chết (16,67%) đều không lớn lắm nên tạo được nhiều mẫu sạch nhất (63,33%).
Như vậy, theo nghiên cứu của chúng tôi, hạt dẻ Trùng Khánh được khử trùng với cồn 70o
trong 7 phút và javen 65% trong 25 phút là công thức thích hợp nhất.
A B C
D E
Hình 3.5. Các giai đoạn trong tạo nguyên liệu khởi đầu
A: Hạt dẻ chưa bóc vỏ B: Hạt dẻ đã bóc lớp vỏ cứng C: Hạt dẻ đã bóc lớp vỏ gai D: Hạt dẻ sau khử trùng E: Hạt dẻ sau khử trùng 2 tuần
3.2.2. Ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng nhân chồi của dẻ Trùng Khánh trong phòng thí nghiệm
3.2.2.1. Ảnh hƣởng riêng rẽ của BAP đến khả năng tạo chồi
Các cây con mọc từ hạt khi có kích thước 4cm - 7cm được cắt thành từng đoạn có kích thước 2cm - 3cm và đưa sang môi trường tạo chồi có thành phần: WPM + BAP (0,2mg/l; 0,5mg/l; 1mg/l; 1,2mg/l; 1,5mg/l) + đường sucrose 25g/l + agar 8,5g/l + nước dừa 200ml/l, pH = 5,7 - 5,8. Theo dõi sự
phát sinh chồi với các chỉ tiêu: tỉ lệ mô tạo chồi, số chồi/mô, chiều cao chồi và màu sắc chồi sau 2 và 4 tuần, chúng tôi thu được kết quả trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng phát sinh chồi
CT BAP (mg/l)
Tỉ lệ mô tạo chồi (%)
Số chồi/mô (chồi/mô)
Chiều cao chồi
(cm) Màu sắc chồi X ±mx % so với ĐC X±mx % so với ĐC X ±mx % so với ĐC Sau 2 tuần ĐC 0,0 44,44±0,18 100,00 1,25±0,25 100,00 0,91±0,17 100,00 XBT 1 0,2 55,56±0,18 125,02 1,33±0,21 106,67 1,29±0,09 141,76 XBT 2 0,5 100,00±0,00 225,02 1,44±0,18 115,56 1,24±0,11 136,26 XBT 3 1,0 88,89±0,11 200,02 1,38±0,18 114,29 1,06±0,14 116,48 XN 4 1,2 66,67±0,17 150,02 1,17±0,17 93,33 0,99±0,14 108,79 XBT 5 1,5 77,78±0,15 175,02 1,29±0,18 102,86 0,95±0,16 104,40 XBT Sau 4 tuần ĐC 0,0 55,56±0,18 100,00 1,25±0,25 100,00 1,83±0,22 100,00 XBT 1 0,2 66,67±0,17 134,00 1,50±0,22 120,00 2,53±0,27 138,43 XBT 2 0,5 100,00±0,00 200,00 1,56±0,18 124,44 2,83±0,24 154,64 XBT 3 1,0 88,89±0,11 178,00 1,43±0,20 110,00 2,23±0,25 121,71 XN 4 1,2 66,67±0,17 178,00 1,33±0,24 106,67 2,21±0,30 120,77 XBT 5 1,5 77,78±0,15 200,00 1,44±0,18 115,56 2,01±0,24 109,79 XBT
XBT: xanh bình thường; XN: xanh nhạt)
Kết quả bảng 3.7 cho thấy, tất cả các công thức bổ sung BAP với nồng độ khác nhau từ 0,2mg/l đến 1,5mg/l đều thấy có sự phát sinh chồi. Ở công thức bổ sung BAP với nồng độ 0,5mg/l cho tỉ lệ mô tạo chồi đạt kết quả cao
nhất (100%). Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến số chồi/mô và chiều cao chồi cho thấy, ở công thức không bổ sung BAP (ĐC) và bổ sung BAP với nồng độ thấp (0,2mg/l) cho số lượng chồi không cao (sau 4 tuần đạt 1,25 chồi/mô ở môi trường không bổ sung BAP và 1,50 chồi/mô ở môi trường bổ sung BAP 0,2mg/l). Khi bổ sung BAP với nồng độ cao hơn (1,0mg/l; 1,2mg/l và 1,5mg/l), số chồi/mô cũng không lớn (đạt 1,38; 1,33 và 1,44 chồi/mô sau 4 tuần). Riêng ở môi trường có bổ sung BAP với nồng độ 0,5mg/l số chồi/mô không lớn (1,44 chồi/mô sau 2 tuần và 1,56 chồi /mô sau 4 tuần) nhưng chiều cao chồi sau 4 tuần lại cho kết quả cao nhất, đạt 2,83cm (cao hơn 54,64% so với đối chứng).
A B
Hình 3.6: Ảnh hưởng của BAP đến sự tạo chồi (sau 4 tuần) A: BAP 1mg/l B: BAP 0,5mg/l
Như vậy, môi trường WPM + nước dừa 200ml/l+ đường sucrose 25g/l + BAP 0,5mg/l + agar 8,5g/l có tỉ lệ phát sinh chồi, số chồi/mô cũng như chiều cao chồi sau các thời gian theo dõi là tốt nhất.
3.2.2.2. Kết quả thăm dò ảnh hƣởng của tổ hợp BAP và kinetin đến khả năng tạo chồi
BAP và kinetin là các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin. Theo nhiều kết quả nghiên cứu thì BAP và kinetin đều ảnh hưởng đến sự tạo chồi. Tuy nhiên, tác động của chúng trên các đối tượng
thực vật đến sự tạo chồi có sự khác nhau. Chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp 2 chất kích thích sinh trưởng này đến sự phát sinh chồi của dẻ Trùng Khánh.
Các đoạn thân có kích thước từ 4cm - 7cm được cắt thành từng đoạn khoảng 2cm - 3cm và nuôi cấy trên môi trường WPM có bổ sung 200ml nước dừa, chất kích thích sinh trưởng kinetin và BAP với các nồng độ khác nhau. Kết quả sau 6 tuần theo dõi đ ược trình bày trong bảng 3.8.
Kết quả bảng 3.8 cho thấy, ở công thức đối chứng (môi trường không bổ sung BAP và kinetin) và các công thức thí nghiệm hạt dẻ đều tạo chồi (dao động từ 43,48% đến 95,65%). Tỉ lệ tạo chồi khi bổ sung tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và kinetin với các nồng độ khác nhau không có sự khác biệt rõ ràng nhưng số chồi/mô và chiều cao chồi lại có sự khác biệt lớn. Đa số các công thức đều đạt trung bình trên 2 chồi/mô, trong đó có 18/25 công thức đạt từ 2,00 đến 2,75 chồi/mô. Số chồi/mô cao nhất ở công thức môi trường bổ sung BAP 0,5mg/l + kinetin 0,5mg/l (đạt 2,75 chồi/mô). Chiều cao chồi đạt từ 1,51cm đến 1,94cm và lớn nhất ở công thức có bổ sung BAP 0,5mg/l + kinetin 0,5mg/l.
So sánh khả năng tạo chồi của cây dẻ Trùng Khánh với 1 số loại cây thân gỗ khác thì thấy khả năng tạo chồi của cây dẻ tốt hơn cây thông đỏ [10], nhưng lại không cao bằng cây keo lai [26]. Nồng độ BAP + kinetin thích hợp nhất cho sự tạo chồi ở cây keo lai và cây dẻ tương tự nhau nhưng nồng độ kinetin ở cây thông đỏ cao hơn (BAP 0,5mg/l+ kinetin 1mg/l).
Như vậy, môi trường có thành phần: WPM + nước dừa 200ml/l + BAP 0,5mg/l + kinetin 0,5mg/l + đường sucrose 25g/l + agar 8,5g/l là công thức cho tỉ lệ mô tạo chồi, số chồi/mô và chiều cao chồi tốt nhất.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và BAP đến sự phát sinh chồi (Sau 6 tuần)
Công thức
Tỉ lệ mô tạo chồi (%)
Số chồi (chồi/mô)
Chiều cao chồi
(cm) Màu sắc chồi BAP mg/l Ki mg/l X ±mx % so với ĐC X±mx % so với ĐC X ±mx % so với ĐC 0,0 0,0 52,17±0,11 100,00 1,67±0,33 100,00 1,59±0,16 100,00 XBT 0,2 0,5 68,18±0,10 130,69 2,00±0,31 119,76 1,56±0,13 98,11 XBT 0,2 1,0 91,30±0,06 175,00 2,40±0,51 143,71 1,55±0,23 97,48 XBT 0,2 1,2 47,83±0,12 91,68 2,17±0,31 129,94 1,52±0,11 95,60 XBT 0,2 1,3 65,22±0,13 125,01 1,86±0,26 111,38 1,59±0.23 100,00 XBT 0,2 1,5 52,17±0,11 100,00 2,38±0,32 142,51 1,81±0,17 113,84 XBT 0,2 2,0 65,22±0,13 125,01 2,40±0,24 143,71 1,65±0,14 103,77 XBT 0,5 0,5 95,65±0,02 183,34 2,75±0,25 164,67 1,94±0,12 122,01 XBT 0,5 1,0 86,96±0,07 166,69 2,29±0,42 137,13 1,80±0,18 113,21 XBT 0,5 1,2 82,61±0,08 158,35 2,38±0,42 142,51 1,81±0,17 113,84 XBT 0,5 1,3 91,30±0,06 175,00 2,29±0,29 137,13 1,58±0,12 99,37 XN 0,5 1,5 60,87±0,12 116,68 2,43±0,30 145,51 1,65±0,16 103,77 XN 0,5 2,0 78,26±0,09 150,01 2,50±0,33 149,70 1,76±0,16 110,69 XBT 1 0,5 78,26±0,09 150,01 2,57±0,37 153,89 1,62±0,14 101,89 XBT 1 1,0 60,87±0,10 116,68 2,20±0,37 131,74 1,66±0,10 104,40 XBT 1 1,2 82,61±0,08 158,35 2,17±0,31 129,94 1,60±0,16 100,63 XBT 1 1.3 73,91±0,09 141,67 2,13±0,30 127,54 1,73±0,18 108,81 XBT 1 1,5 82,61±0,07 158,35 2,13±0,40 127,54 1,86±0,11 116,98 XBT 1 2,0 60,87±0,15 116,68 1,71±0,36 102,40 1,51±0,19 94,97 XBT
1,5 0,5 56,52±0,11 108,34 2,38±0,26 142,51 1,60±0,18 100,63 XBT 1,5 1,0 69,57±0,13 133,35 2,14±0,34 128,14 1,35±0,20 84,91 XBT 1,5 1,2 56,52±0,11 108,34 2,33±0,21 139,52 1,52±0,12 95,60 XBT 1,5 1,3 78,26±0,09 150,01 1,83±0,40 109,58 1,28±0,09 80,50 XBT 1,5 1,5 43,48±0,11 83,34 1,88±0,23 112,57 1,51±0,16 94,97 XBT 1,5 2,0 73,91±0,09 141,67 1,89±0,24 113,17 1,67±0,12 105,03 XBT
(XBT: xanh bình thường; XN: xanh nhạt)
A B
Hình 3.7. Ảnh hưởng của BAP + kinetin đến sự tạo chồi (sau 6 tuần)
A: BAP 0,2mg/l + kinetin 1mg/l B: BAP 0,5mg/l + kinetin 0,5mg/l
3.2.2.3. Ảnh hƣởng của tổ hợp chất kích thích sinh trƣởng thuộc nhóm NAA và BAP đến khả năng tạo cụm chồi
Để nghiên cứu khả năng tạo cụm chồi, chúng tôi tiến hành cấy các đoạn thân có kích thước từ 2cm - 3cm trên môi trường WPM có bổ sung NAA và BAP với các nồng độ khác nhau và nước dừa. Theo dõi thí nghiệm sau 3 và 6 tuần, chúng tôi thu được kết quả trình bày ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng tạo cụm chồi (sau 6 tuần)
Công thức Tỉ lệ mô tạo chồi (%)
Số chồi (chồi/mô)
Chiều cao chồi
(cm) Màu sắc chồi BAP (mg/l) NAA (mg/l) X±mx % so ĐC X ±mx % so ĐC X ±mx % so ĐC 0,0 0,0 57,17±0,11 100,00 2,00±0,71 100,00 3,20±0,33 100,00 XBT 0,5 0,05 50,00±0,14 87,46 4,00±1,03 200,00 3,86±0,42 120,63 XBT 0,5 0,1 71,43±0,13 124,94 4,17±1,06 275,00 3,90±0,27 121,88 XBT 0,5 0,2 92,86±0,07 162,43 5,50±1,05 208,50 4,19±0,33 130,94 XN 0,5 0,3 57,14±0,14 99,95 4,33±1,09 216,50 3,86±0,32 120,63 XBT 0,5 0,4 50,00±0,14 87,46 3,50±0,85 175,00 3,62±0,39 113,13 XBT 1,0 0,05 78,57±0,12 137,43 4,33±1,12 216,50 3,99±0,44 124,69 XBT 1,0 0,1 84,62±0,15 148,01 4,33±1,15 216,50 3,74±0,32 116,88 XBT 1,0 0,2 64,29±0,13 112,45 4,67±0,84 233,50 3,51±0,40 109,69 XBT 1,0 0,3 92,86±0,07 162,43 3,67±1,02 183,50 3,18±0,33 99,38 XBT 1,0 0,4 65,28±0,13 114,19 4,00±1,00 200,00 3,31±0,41 103,44 XBT 1,5 0,05 78,46±0,11 137,24 4,00±1,03 200,00 3,38±0,39 105,63 XBT 1,5 0,1 71,22±0,12 124,58 3,83±0,95 191,50 3,16±0,27 98,75 XBT 1,5 0,2 76,55±0,12 133,90 3,50±0,43 175,00 3,80±0,46 118,75 XBT 1,5 0,3 67,17±0,10 100,00 3,50±0,76 175,00 3,79±0,33 118,44 XBT 1,5 0,4 50,25±0,15 87,46 2,00±0,71 100,00 3,96±0,29 123,75 XBT
(XBT: Xanh bình thường; XN: Xanh nhạt)
Kết quả cho thấy, tỉ lệ mô tạo cụm chồi không cao hơn nhiều so với môi trường có bổ sung tổ hợp BAP + kinetin. Tuy nhiên, số chồi/mô lại có sự tăng khá lớn, dao động từ 2,00 chồi/mô đến 5,50 chồi/mô. Chiều cao chồi ở môi trường có bổ sung BAP và NAA với các nồng độ khác nhau cũng đạt giá trị khá lớn dao động từ 3,16cm đến 4,19cm. Trong đó, môi trường bổ sung
BAP 0,5mg/l + NAA 0,2mg/l cho số chồi/mô cũng như chiều cao chồi đều cao (đạt 5,5 chồi/mô và cao trung bình 4,19cm). Như vậy, trong thí nghiệm này, sự kết hợp giữa BAP và NAA thích hợp với sự tạo cụm chồi hơn công thức kết hợp giữa BAP và kinetin; môi trường có công thức: BAP 0,5mg/l + NAA 0,2mg/l có tỉ lệ mô tạo chồi, số chồi/mô và chiều cao chồi tốt nhất.
Ở lim xanh cũng đã nghiên cứu được môi trường tốt nhất cho nhân nhanh chồi là môi trường bổ sung BAP 0,05mg/l+ kinetin 0,05mg/l + NAA (0 - 0,1mg/l) với số chồi/mô và chiều cao chồi có giá trị tương tự [11].
A B
Hình 3.8. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tạo chồi dẻ (sau 6 tuần)
A: BAP 0,5mg/l + NAA 0,2mg/l B: BAP 0,5mg/l + NAA 0,1mg/l
3.2.3. Ảnh hƣởng của NAA đến khả năng ra rễ dẻ
Tham khảo môi trường ra rễ của 1 số loại cây như: Pơmu [3], thông đỏ [12], giá ty [27], keo lai [28], lim xanh [11], thông Caribe [13]…chúng tôi nhận thấy, khả năng ra rễ của các cây phần lớn chịu ảnh hưởng của IBA hoặc NAA với nồng độ thấp. Với cây dẻ Trùng Khánh, chúng tôi nghiên cứu môi trường tạo rễ của chúng bằng cách bổ sung NAA với các nồng độ: 0,05; 0,1; 0,2; 0,3 và 0,4mg/l vào môi trường WPM. Theo dõi sự ra rễ sau 4 tuần và 8