chồi ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài của rễ
Giai đoạn ra rễ là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đủ thân, lá và rễ. Giai đoạn này các chất có tác dụng kích thích tạo chồi và vươn cao của chồi được loại bỏ. Thay vào đó là các chất có tác dụng kích thích ra rễ, do vậy các chất auxin thường được sử dụng bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô tế bào. Giai đoạn này không cần sự sinh trưởng về chiều cao mà chỉ cần tạo rễ cho chồi nên nồng độ auxin, đường, các chất dinh dưỡng khác trong môi trường nuôi cấy cũng được giảm xuống 1/2.
IBA là chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm auxin, thường được sử dụng hầu hết trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, có tác dụng tạo rễ cho chồi. Nó được sử dụng khác nhau phụ thuộc vào loài dao động từ 0,5 - 5 mg/l. Đề tài bổ sung IBA với các nồng độ là: 0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 mg/l vào môi trường 1/2MS*
+ 15 g/l đường + 5 g/l, sau 2 tuần theo dõi được kết quả là:
IBA có ảnh hưởng rõ đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài trung bình của rễ. Tỷ lệ ra rễ và số rễ trung bình trên cây tăng rất nhiều khi bổ sung với nồng độ 1,0 và 2,0 mg/l. Dòng UE35 có tỷ lệ chồi ra rễ đạt 14,4%, số rễ trung
bình/cây đạt 0,54 rễ/ cây. Dòng UE56 có số chồi ra rễ là 13,9%, số rễ trung bình/ cây là 0,50 rễ/cây. Khi bổ sung IBA lên nồng độ 1,0 và 2,0 mg/l thì hệ số trên tăng mạnh và cao nhất ở nồng độ 2,0 mg/l là (dòng UE35 là 76,1% và 2,59 rễ/cây; dòng UE56 là 75%, 2,53 rễ/cây). Nhưng chiều dài trung bình của rễ cao nhất khi IBA được bổ sung ở nồng độ 1,0 mg/l (dòng UE35 là 1,16 cm; dòng UE56 là 1,09 cm). Nồng độ IBA tăng ở các nồng độ 3,0 và 4,0 nhưng các chỉ tiêu trên lại giảm.
Qua quan sát thấy khi bổ sung IBA thì thấy mặt cắt của chồi cấy sùi to tạo thành callus, những rễ tạo thành rất ngắn. Rễ được tạo thành trong trường hợp này có thể do hàm lượng NAA còn có mặt trong chồi nuôi cấy từ quá trình nhân chồi ở các thí nghiệm trên. Các nồng độ 3,0 và 4,0 mg/l xuất hiện nhiều rễ có mầu đen hoặc đầu rễ bị đen, những rễ này thường phát triển chậm khi cấy ra bầu và có nhiều chồi sùi đen tại phần tiếp xúc với môi trường ra rễ.
Bảng 3.10. Ảnh hƣởng nồng độ IBA đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình và chiều dài của rễ (180 chồi cây/ công thức)
Nồng độ IBA (mg/l) Dòng UE35 Dòng UE56 Hình thái rễ Tỷ lệ chồi ra rễ (%) Số rễ trung bình (rễ/cây) Chiều dài trung bình rễ (cm) Tỷ lệ chồi ra rễ (%) Số rễ trung bình (rễ/cây) Chiều dài trung bình rễ (cm) 0 14,4 0,54 0,52 13,9 0,50 0,48 Rễ ngắn, dòn dễ gẫy 1,0 59,4 2,04 1,16 61,1 1,84 1,09 Rễ dài, dòn, đen nhiều rễ phụ 2,0 76,1 2,59 0,87 75,0 2,53 0,86 Rễ khoẻ và rễ trắng, đều 3,0 53,3 2,07 0,78 51,7 2,03 0,71 Rễ dài, mảnh, đầu rễ đen 4,0 45,0 1,40 0,67 42,2 1,82 0,66 Rễ ngắn, dòn, đen
Kết quả phân tích thống kê ảnh hưởng của nồng độ IBA đến các chỉ tiêu ra rễ (tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây, chiều dài trung bình của rễ) của 2 dòng UE35 và UE56 cho thấy (phụ lục 14):
- Ảnh hưởng của IBA đến các chỉ tiêu nói trên với độ tin cậy 95%, theo phương pháp phân nhóm Duncan thu được nồng độ 2,0 mg/l là tốt nhất cho tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây. Nồng độ 1,0 mg/l tốt nhất cho chiều dài trung bình của rễ. Hai chỉ tiêu tỉ lệ ra rễ, số rẽ trung bình/cây ảnh hưởng rõ rệt hơn chỉ tiêu chiều dài của rễ đến chất lượng cây con và tỷ lệ sống của cây tại vườn ươm. Vì thế chúng tôi
Biểu đồ 3.7a. ¶nh hƣởng của nồng độ IBA tới tỷ lệ ra rễ của 2 dòng UE35 và UE56
0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 Nồng độ IBA (mg/l) Tỷ lệ ra rễ (%) Dòng UE35 Dòng UE56
Biểu đồ 3.7b. ¶nh hƣởng của nồng độ IBA tới số rễ trung bình của 2 dòng UE35 và UE56
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 Nồng độ IBA (mg/l) Số rễ trung bình (rễ/cây) Dòng UE35 Dòng UE56
chọn môi trường 1/2MS*
+ 15 g/l đường + 5 g/l agar + 2,0 mg/l IBA, pH=6,5 cho môi trường thử nghiệm tiếp theo đối với chỉ tiêu ra rễ của 2 dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56.
3.5.7. Ảnh hưởng của tổ hợp IBA + ABT1 đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài của rễ
ABT1 là chất điều hoà sinh trưởng của Trung Quốc, đây là chất kích thích hình thành rễ bất định. Hiện nay ABT1 được sử dụng rất nhiều để tạo cây hoàn chỉnh trong nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, cũng như trong giâm hom Bạch đàn ở nước ta.
Với mục tiêu xác định được môi trường tốt hơn cho tạo rễ, đề tài bổ sung ABT1 ở các nồng độ là: 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l vào môi trường 1/2MS* + 2,0 mg/l IBA + 15 g/l đường + 5 g/l agar, pH=6,5, dùng môi trường không bổ sung ABT1 làm đối chứng. Kết quả là:
Bảng 3.11: Ảnh hƣởng của tổ hợp IBA + ABT1 đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình và chiều dài rễ của dòng UE35 và UE56
Nồng độ ABT1 (mg/l) Dòng UE35 Dòng UE56 Hình thái rễ Tỷ lệ chồi ra rễ (%) Số rễ trung bình (rễ/cây) Chiều dài TB của rễ (cm) Tỷ lệ chồi ra rễ (%) Số rễ trung bình (rễ/cây) Chiều dài TB của rễ (cm) 0 75,6 2,60 1,09 75,0 2,39 1,06 Đầu rễ đen 0,5 82,2 2,85 1,29 81,7 2,59 1,16 Đầu rễ trắng, mập và đều 1,0 66,7 2,54 0,91 65,6 2,44 0,88 Đầu rễ trắng, dài 1,5 59,4 2,50 0,74 55,0 1,97 0,69 Đầu rễ đen, mảnh, dài 2,0 42,2 2,01 0,65 45,0 1,80 0,58 Đầu rễ đen, ngắn
Nồng độ ABT1 cho hiệu quả tốt nhất là 1,0 mg/l với dòng UE35 tỷ lệ chồi ra rễ đạt 82,1%, số rễ trung bình là 2,85 rễ/cây, chiều dài trung bình của rễ là 1,29 cm. Còn dòng UE56 các chỉ số là 81,7%, 2,59 rễ/cây, chiều dài trung bình 1,16 cm. Ở những nồng độ cao hơn tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình/cây, chiều dài trung bình của rễ đều giảm mạnh ở cả 2 dòng, quan sát thấy khi tăng nồng độ lên 1,5 và 2,0 mg/l xuất hiện nhiều rễ bị đen, chiều dài rễ ngắn hơn so với nồng dộ 1,0 mg/.
- Phân tích phương sai về ảnh hưởng của nồng độ ABT1 đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây, chiều dài trung bình của dòng UE35 thấy (phụ lục 15):
- Chỉ tiêu tỷ lệ ra rễ có giá trị Sig = 0,457 > 0,05 trong bảng kiểm tra phương sai tổng thể nên đề tài sử dụng so sánh phương sai để đánh giá sự sai khác. Chỉ tiêu
Biểu đồ 3.8b.
của 2 dòng UE35 và UE56
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Nồng độ IBA + ABT1 (mg/l) Số rễ trung bình (rễ/cây) Dòng UE35 Dòng UE56
Biểu đồ 3.8a. ¶nh hƣởng của nồng độ IBA + ABT1 tới tỷ lệ ra rễ của 2 dòng UE35 và UE56
0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Nồng độ IBA + ABT1 (mg/l) Tỷ lệ ra rễ (%) Dòng UE35 Dòng UE56
số rễ trung bình/cây có Sig = 0,03 < 0,05 nên đề tài sử dụng tiêu chuẩn Tamhane’sT2 để so sánh.
- Kết quả phân tích phương sai trong bảng Anova thấy tỷ lệ ra rễ có giá trị Sig của F= 0,00 < 0,05 vậy tỷ lệ ra rễ ở các công thức có sự sai khác rõ rệt. Chiều dài trung bình của rễ cũng thay đổi rõ rệt, bảng tiêu chuẩn Tamhane’sT2
cho thấy số rễ trung bình/cây ở các công thức nồng độ có sự sai khác rõ rệt. Sai khác có độ tin cậy với α = 0,05.
- Phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan thu được công thức có nồng độ ABT1 bằng 0,5 mg/l là tốt cho tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây, chiều dài trung bình của rễ với độ tin cậy 95%.
- Phân tích tương tự như trên, ở dòng UE56 được tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây, chiều dai trung bình của rễ ở các công thức có nồng độ khác nhau rõ rệt với α=0,05. Công thức với nồng độ 0,5 mg/l ABT1 là tốt nhất cho tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây, chiều dài trung bình rễ với độ tin cậy 95%.
Ảnh 3. 8. Chồi nuôi cấy trong môi trƣờng có bổ sung ABT1 sau 15 ngày nuôi cấy
3.5.8. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao của cây con ở vườn ươm con ở vườn ươm
Đưa cây con ra ngoài vườn ươm là giai đoạn quan trọng trong quá trình sản xuất cây giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, nó có ý nghĩa đến ứng dụng quá trình vi nhân giống vào thực tiễn sản xuất. Đề tài thử nghiệm ảnh hưởng của 5 khoảng thời gian huấn luyện cây con như sau: Không huấn luyện; huấn luyện 4, 8, 12, 16 ngày để nghiên cứu tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây con ở vườn ươm. Kết quả thu được sau 4 tuần ngoài vườn ươm là:
Bảng 3.12: Ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống của cây con tại vƣờn ƣơm sau 1 tháng (90 cây mạ/công thức)
Thời gian huấn luyện (ngày) Dòng UE35 Dòng UE56 Tỷ lệ sống (%) Chiều cao trung bình (cm) Tỷ lệ sống (%) Chiều cao trung bình (cm) 0 45,6 6,26 44,4 6,20 4 75,7 6,30 72,2 6,27 8 93,3 6,43 92,2 6,40 12 92,2 6,40 92,2 6,37 16 86,7 6,17 87,8 6,20
(Thời gian huấn luyện 28/8/2007 - 28/9/2008)
Từ kết quả bảng trên, thời gian huấn luyện có ảnh hưởng rõ đến tỷ lệ sống của cây con tại vườn ươm. Cây con không được huấn luyện đạt tỷ lệ sống rất thấp (dòng UE35 là 45,6%, dòng UE56 là 44,4%). Tỷ lệ sống tăng lên với thời gian huấn luyện 4 ngày, 75,6% dòng UE35 và 72,2% ở dòng UE56. Thời gian huấn luyện 8 ngày đạt tỷ lệ sống giảm không đáng kể, tỷ lệ sống giảm ít ở thời gian huấn luyện 16 ngày. Qua quan sát thấy với công thức 16 ngày rễ của cây con trong bình thường bị đen, xuất hiện nhiều rễ chết, có thể đã chết sau khi cấy ra vườn ươm. Ngược lại với tỷ lệ sống, chiều cao trung bình ở cả 2 dòng thay đổi không đáng kể ở các công thức.
So sánh phương sai về ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao của 2 dòng thu được kết quả (phụ lục 16): với dòng UE35 có giá trị Sig trong bảng phương sai tổng thể của chỉ tiêu tỷ lệ sống bằng 0,250, của chỉ tiêu chiều cao trung bình bằng 0,556. Dòng UE56 có giá trị Sig của chỉ tiêu tỷ lệ sống là 1,71, chỉ tiêu chiều cao trung bình 1,71. Như vậy phương sai của biến ngẫu nhiên bằng nhau.
Bảng phân tích phương sai thu được kết quả Sig trong bảng Anova, chỉ tiêu tỷ lệ sống ở 2 dòng đều bằng 0,00. Vì thế, tỷ lệ sống của 2 dòng ở các công thức có
sự sai khác với α = 0,05, giá trị Sig của chiều cao trung bình ở 2 dòng đều > 0,05 (bằng 0,186 ở dòng UE35 và dòng UE56 là 0,32). Ta thấy chỉ số chiều cao trung bình của cây con ở hai dòng không có sự sai khác giữa các công thức.
Phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan thấy tỷ lệ sống ở 3 khoảng thời gian huấn luyện 8 ngày, 12 ngày và 16 ngày ở cùng một nhóm tốt nhất với cả 2 dòng, như vậy 3 công thức huấn luyện này không có sự sai khác về mặt thống kê, kết quả có độ tin cậy 95%.
Cây con dòng UE35 Cây con dòng UE56 Cây con dòng UE35 và UE56
¶nh 3.9. C©y con t¹i v-ên -¬m cña 2 dßng
Chƣơng 4
KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
Quá trình nghiên cứu về 2 dòng Bạch đàn UE35 và UE56 đề tài thấy sinh trưởng và phát triển của 2 dòng trên chịu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy. Thành phần và nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng ảnh hưởng mạnh và rõ đến hiệu quả quá trình nhân nhanh chồi và tạo cây hoàn chỉnh.
1. Chất khử trùng mẫu cho 2 dòng Bạch đàn UE35 và UE56 tốt nhất là HgCl2
nồng độ 0,1%, thời gian khử trùng là 10 phút.
2. Mùa vụ thích hợp và cho tỷ lệ nẩy chồi cao nhất cho dòng UE35 và UE56 là tháng 7-9 với tỷ lệ mẫu nẩy chồi lần lượt là 15,76 và 16,05 sau 27 ngày nuôi cấy.
3. Vitamin cần thiết cho giai đoạn nhân chồi với 2 dòng Bạch đàn là UE35 và UE56 là: MS* + 2,0 mg/l B2 + 30 mg/l đườngSucrose + 5 g/l agar, pH = 6,5 4. Môi trường tạo chồi và nhân chồi thích hợp cho dòng UE35 là: MS*
+ 2,0 mg/l B2 + 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA + 0,5 mg/l Kinetin + 30 g/l đường Sucrose + 5 g/l agar, pH=6,5.
5. Môi trường tạo chồi và nhân chồi thích hợp cho dòng UE56 là: MS*
+ 2,0 mg/l B2 + 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA + 1,0 mg/l Kinetin + 30 g/l đường Sucrose + 5 g/l agar, pH=6,5.
6. Môi trường tạo cây hoàn chỉnh ra rễ với cả 2 dòng là 1/2MS*
+ 2,0 mg/l IBA + 0,5 ng/l ABT1 + 15 g/l đường Sucrose + 5 g/l agar, pH = 6,5.
7. Thời gian huấn luyện cây con tốt cho 2 dòng trước khi cấy ở vườn ươm là 8 - 16 ngày.
4.2. Tồn tại
Do thời gian và kinh nghiệm của tác giả có hạn nên đề tài vẫn còn rất nhiều hạn chế:
- Các thí nghiệm về môi trường dinh dưỡng và phối hợp các chất điều hoà sinh trưởng chưa nhiều.
- Chưa tiến hành nghiên cứu phương pháp ra rễ với giá thể bằng cát sông cho 2 dòng Bạch đàn lai nói trên.
4.3. Kiến nghị
Để cho cây con của 2 dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56 này phục vụ cho công tác sản xuất giống cây trồng rừng cần nghiên cứu chi tiết hơn nữa đối với môi trường nhân chồi, đặc biệt là nồng độ chất điều hoà sinh trưởng và một số chất phụ gia, vitamin khác bổ sung vào môi trường nuôi cấy.
- Tiếp tục nghiên cứu nhân giống các loại vật liệu khác như phôi hạt, lá… - Nghiên cứu thêm về một số giá thể phù hợp với dòng Bạch đàn lai đã được
Cây cung cấp vật liệu đưa mẫu vào
Chồi cấy; mẫu cấy sau 20 ngày nuôi cấy; chồi cấy dùng nhân nhanh
Mẫu được cấy trong môi trường nhân nhanh
Chồi cấy sang môi trường ra rễ; cây huấn luyện và cấy ra ngoài bầu đất
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
1. Andrew I. (1991), “Thiết kế đơn giản cho các thí nghiệm lâm nghiệp”, Bản tin, Viện nghiên cứu lâm nghiệp (số 71), 39 trang.
2. Dương Mộng Hùng (1993), Chọn cây trội và nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào cho hai loài Bạch đàn E. camaldulensis và E. urophylla, Báo cáo đề tài, trường Đại học Lâm nghiệp, Hà Tây.
3. Đoàn Thị Mai và cộng sự (2000), “Kết quả bước đầu về nhân giống Bạch đàn lai bằng phương pháp nuôi cấy mô phân sinh”, Tạp chí Lâm nghiệp, (số 10/2000), tr. 46-47.
4. Đoàn Thị Mai và cộng sự (2005), “Bước đầu ứng dụng công nghệ mô - hom trong nhân giống Trầm hương”, Tạp chí NN&PTNT (số 2), tr. 57-67.
5. Đoàn Thị Ái Thuyền và cộng sự, (2005), “Nhân giống vô tính cây Hông
(Paulowvina fortunei Hemsi) bằng phương pháp nuôi cấy mô”, Tạp chí sinh học, (số 9), tr. 46-50.
6. Đỗ Tất Lợi (2003), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr. 742-744.
7. Hồ Văn Giảng, Vũ Thị Huệ, (2006), “Xây dựng qui trình nhân giống cây Gió trầm bằng kỹ thuật nuôi cấy mô-tế bào”, Tạp chí Nông nghiệp & phát