4.2.1 RT-PCR với Taq Beat trên RNA ly trích từ huyết thanh bằng TRIzol
Sau khi xây dựng được quy trình RT-PCR trên mẫu chuẩn với Taq Beat™ Hot Start, Taq polymerase của công ty Biorad và công ty ABgene, chúng tôi thực hiện RT- PCR sử dụng Taq Beat Hot Start với RNA ly trích từ 5 mẫu huyết thanh của các heo đã có kết quả ELISA dương tính với virus gây bệnh PRRS. RNA này được chiết xuất theo quy trình Sử dụng TRIzol. Kết quả được thể hiện trên hình 4.3
Ghi chú: Giếng C: mẫu chuẩn Lad: Thang chuẩn Giếng 5, 10, 16, 21, 22: Các mẫu ly trích theo TRIzol Lad: Thang chuẩn Nồng độ gel: 1%
Hiệu điện thế: 100 V Thời gian: 30 phút
Hình 4.3. Sản phẩm RT-PCR với Taq Beat trên mẫu chuẩn và 5 mẫu ly trích theo TRIzol.
C 5 10 Lad 16 21 22
Kết quả trên hình 4.3 cho thấy mẫu chuẩn có một băng có kích thước 400bp đúng như mong đợi. Tuy nhiên, tất cả các mẫu ly trích đều không cho một sản phẩm khuếch đại nào. Điều này có thể do các mẫu này không có RNA của virus do đó quá trình khuếch đại đã không xảy ra. Tuy nhiên cũng có thể giải thích là do quy trình ly trích bằng TRIzol chưa ổn định nên không thu nhận được RNA của virus. Để chứng minh giả thuyết này, chúng tôi đã tiến hành lại quá trình ly trích bằng TRIzol một lần nữa trên các mẫu ban đầu và một số mẫu khác nhưng vẫn không thu được kết quả dương tính trên mẫu ly trích (kết quả không trình bày).
Để đảm bảo có thể thu nhận được RNA của virus nếu chúng có hiện diện trong các mẫu huyết thanh, chúng tôi đã tiến hành quá trình ly trích bằng cách sử dụng bộ kít QIAamp® Viral RNA Mini Kit. Tuy nhiên kết quả thu được vẫn là âm tính trên các mẫu ly trích khi thực hiện RT-PCR với Taq Beat Hot Start. Điều này có thể do mẫu huyết thanh không có hoặc có rất ít RNA virus. Do đó chúng tôi sử dụng các mẫu đã qua giai đoạn tăng sinh bằng nuôi cấy tế bào và sử dụng quy trình ly trích theo bộ kit.
4.2.2 Kết quả RT - PCR theo quy trình dùng Taq ABGENE trên các mẫu ly trích từ dịch nuôi cấy tế bào đƣợc ly trích theo bộ kit
Ghi chú: Giếng C: mẫu chuẩn
Giếng 23, 24, 25, 34, 35: Các mẫu ly trích theo bộ kit Lad: Thang chuẩn
24
400 bp
Hình 4.4: Sản phẩm RT-PCR dùng Taq ABgene trên mẫu chuẩn và 5 mẫu ly trích theo bộ kít
C 23 24 25 34 43
Hình 4.5: Sản phẩm điện di RNA sau quá trình ly trích
Trong lần này, chúng tôi ly trích RNA từ 5 mẫu dịch nuôi cấy tế bào với kết quả ELISA có phản ứng dương tính với virus PRRS (mẫu 23, mẫu 24, mẫu 25, mẫu 34, mẫu 43). Những mẫu này đã qua ly tâm để loại bỏ phần tủa tế bào. Tiến hành RT- PCR trên các mẫu ly trích và một mẫu chuẩn (mẫu C). Kết quả cho thấy chỉ mẫu chuẩn có một băng dương tính và các mẫu ly trích còn lại không có kết quả. Để đảm bảo sự chính xác của kết quả, chúng tôi tiếp tục ly trích lại bằng bộ kit, tuy nhiên kết quả vẫn là âm tính. Do đó, có thể nhận định rằng các mẫu nuôi cấy và huyết thanh heo không chứa virus PRRS tại thời điểm lấy mẫu.
4.3 Điện di RNA trên mẫu ly trích
Để tạo điều kiện thuận lợi cho việc thu nhận RNA tổng số, chúng tôi đã tiến hành ly trích theo quy trình sử dụng TRIzol trên mẫu phổi. Kết quả được thể hiện trong hình 4.5
Trên hình 4.5, theo chúng tôi là hai băng của RNA ribosome trên gel biến tính. Vì không có thang chuẩn có kích thước lớn (5kb) nên chưa thể xác định được đây là hai loại RNA ribosome nào. Tuy nhiên, ở đây chúng tôi chỉ kiểm tra khả năng thu nhận RNA sau quá trình ly trích nên với kết quả này có thể kết luận với quy trình ly trích trong thí nghiệm hoàn toàn có thể thu nhận được RNA nếu có sự tồn tại RNA trong mẫu kiểm tra.
Ghi chú:
Nồng độ gel: 1,5 % Hiệu điện thế: 30 V
4.4 Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp primer
Trong khi mẩu RNA chuẩn của virus gây bệnh PRRS dòng Olot/91 đã được phát hiện một cách ổn định dựa vào kỹ thuật RT-PCR một bước với cặp mồi của tác giả Rovira; quy trình ly trích đã được chứng minh cho hiệu quả cao trong việc ly trích RNA; mẫu xét nghiệm đã qua kiểm tra ELISA cho kết quả dương tính nhưng chúng tôi vẫn chưa phát hiện một mẫu nào có sự hiện diện của virus. Như vậy, bên cạnh việc nghi ngờ trong mẫu xét nghiệm không có sự tồn tại virus gây bệnh PRRS còn có thể do tính đặc hiệu của cặp mồi Rovira đang sử dụng. Do đó chúng tôi đã sử dụng chương trình Blast của trang web httt://www.ncbi.nlm.nih.gov/ để kiểm tra tính đặc hiệu của cặp primer này. Từ kết quả kiểm tra này cho thấy cặp primer của tác giả Rovira chỉ có khả năng khuếch đại đặc hiệu một loài duy nhất là Olot/91. Các loài khác thì tính đặc hiệu của cặp primer này là rất thấp. Trong khi dó cặp mồi P1, P2 của tác giả Meritxel Donadeu qua kiểm tra cho thấy có khả năng bắt cặp đặc hiệu với RNA của nhiều chủng virus PRRS khác nhau (xem phụ lục). Sử dụng cặp mồi P1, P2 như vậy sẽ làm tăng khả năng phát hiện virus PRRS trong mẫu.
4.5. RT - PCR sử dụng cặp primer p1, p2
Dựa vào kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của hai cặp primer, chúng tôi đã thử nghiệm việc sử dụng cặp primer P1, P2 trong phản ứng RT-PCR một bước đã được thiết kế ở trên để phát hiện virus PRRS trong mẫu huyết thanh ly trích (quy trình và thành phần hóa chất tham gia phản ứng giống như quy trình sử dụng cặp primer Rovira). Trong thí nghiệm này chúng tôi đã tiến hành RT-PCR trên một mẫu chuẩn và 5 mẫu ly trích RNA đã kiểm tra qua quy trình RT-PCR sử dụng cặp mồi theo tác giả Rovira cho kết quả âm tính để dễ dàng so sánh hai cặp primer. Kết quả của thí nghiệm được thể hiện trong hình 4.8.
Hình 4.6. Sản phẩm RT-PCR dùng cặp primerP1, P2 trên một mẫu RNA chuẩn và 5 mẫu huyết thanh ly trích theo quy trình dùng TRIzol.
Ghi chú: Giếng B12, 326, 160, 156, 62: Các mẫu ly trích theo TRIzol Giếng C: mẫu chuẩn Nồng độ gel: 1 %
Hiệu điện thế: 100V Thời gian điện di: 30 phút Như vậy kết quả trên hình 4.8 cho thấy mẫu RNA chuẩn có một băng rất đậm và rõ hơn nhiều so với khi sử dụng cặp mồi Rovira, thêm vào đó khi sử dụng cặp mồi P1, P2 không thấy xuất hiện băng phụ như thường thấy khi sử dụng cặp primer của tác giả Rovira. Điều này chứng tỏ độ nhạy và độ đặc hiệu của cặp primer P1, P2 là rất cao.
Các mẫu xét nghiệm đều không thấy có sự xuất hiện băng mong muốn. Do đó, dựa vào kết quả cuối cùng này và các kết quả thực hiện trong toàn quá trình thí nghiệm, chúng tôi có thể kết luận trong các mẫu ly trích không có sự hiện diện của virus gây bệnh PRRS.
62 156 B12 326 C 160
Phần V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Quy trình RT-PCR sử dụng trong nghiên cứu hoàn toàn cho phép phát hiện được RNA của virus PRRS.
Quy trình ly trích sử dụng TRIzol hoàn toàn có khả năng thu nhận RNA.
Quy trình điện di RNA tổng số có khả năng kiểm tra RNA tổng số sau quá trình ly trích.
Tất cả các mẫu đều không tồn tại virus PRRS ở thời điểm lấy mẫu. Sự hiện diện kháng thể kháng virus gây bệnh PRRS trong huyết thanh không đồng nghĩa với việc có sự hiện diện virus trong máu heo có kháng thể.
5.2. Đề nghị
Cần hoàn thiện hơn nữa quy trình ứng dụng RT-PCR trong việc phát hiện virus PRRS, khử băng phụ và giảm các thành phần phản ứng nhằm làm giảm giá thành cho một phản ứng xét nghiệm.
Thực hiện phản ứng RT-PCR phát hiện virus gây bệnh PRRS trên các mẫu mới lấy từ thú bệnh trong vòng 24 giờ.
Sử dụng song song các cặp mồi Rovira 1,2 và P1, P2 để thực hiện phản ứng RT- PCR phát hiện virus PRRS.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
1. Quách Tuyết Anh, 2003. Một số kinh nghiệm ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện
Mycoplasma hyopneumoniae trên mẫu bệnh tích phổi heo nhục hoá. Luận văn tốt
nghiệp. Khoa Chăn Nuôi Thú Y. Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
2. Phạm Sỹ Lăng, Nguyễn Thiện. Một số bệnh mới do virus ở gia súc và gia cầm nhập
nội và biện pháp phòng trị. NXB Nông Nghiệp, 2002.
3. Lê Quang Nguyên, 2003. Xây dựng quy trình phát hiện virus gây bệnh đầu vàng
YHV (Yellow Head Virus) trên tôm xú (Penaeus monodon) dựa trên phương pháp RT- PCR. Luận vặn tốt nghiệp. Khoa Sinh. Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP. Hồ
Chí Minh.
Tài liệu nƣớc ngoài
4. A. Rovira, M. Balasch, J. Segalés, L. Garcia, J. P;ana-durán, C. Rosell, H. Ellerbrok, A. Mankerz, and M.Domingo. 2002. Experimental inoculation of conventional pigs with porcine respiratory syndrome virus and porcine circovirus.
Journal of Virology. Vol.76, No. 7.
5. Brown T.A. Gene cloning an introduction. 3rd edition, UMIST, Manchester, UK. p. 229 – 249.
6. Chomzynski, P., and N. Sacchi. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate- phenol- chloroform extraction. Anal. Biochem. 162:156-159.
7. Christopher-Hennings J., E. A. Nelson, K. D. Rossow, J. L.Shivers, M. J. Yaeger, C. C. L. Chase, R.A. Gardano, J. E. collins và D. A. Benfield, 1998. Identification of porcine
reproduction and respiratory syndrome virus in semen and tissues from vasectomized and nonvasectormized boars. Vet. Pathol. 35: 260 – 267.
8. Donadeu M, Arias M, Gomez-Tejedor C, et al. Using polychainreaction to obtain PRRS-free piglets from endemically infected herd. Swine health prod. 1999; 7(6): 255-
261.
9. Fun In Wang, 1994. Minimal residues of porcine reproduction and respiratory syndrome virus in pig carcases and boar semen. Proc. Natl. Sci. counc. ROC(B).
Vol.33, No.4, 1994. PP. 167-174.
10. HorterC. D., Pogranicniy R. M., Cheng chang C., R. B.Evans, Kyong-Jin Yoon, J. J. Jimmerman, 2002. Characteration of the carrier State in Porcine reproduction and respiratory syndrom virus infection. Veterinary Microbiology. 86 (2002) p:213 – 218.
11. Meng X.J., Paul P.S., Halbur P.G., Lum M.A., 1995. Phylogenetic analysis of the putative M (ORF6) and N (ORF7) gene for porcine reproduction and respiratory syndrome virus (PRRSV): implication of the existense of two genotypes of PRRSV in the USA and Europe. Arch. Virol. 140: 745-55.
12. Prieto C., José M. Castro, 2005. Procine reproductive and respiratory syndrome virus infection in the boar: a review. Theriogenology. 63: 1-16.*
13. Sambrook and Russell. 2001. Molecule cloning a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. Vol 2. p8.47- 8.53.
14. Wagstrom E. A., Kyong- Jin Joon, and Jeffrey J Zimmerman,. Diagnostic performance of a RT-PCR test for the detection of porcine reproduction and respiratory syndrome in serum. Iowa State University. ADL-R1602.
Các trang web 15.http://www.ctu.edu.vn/institutes/farming/jircas/JIRCAS/research/workshop/pro03/ C9-Livestock %209 %20(Kamakawa).pdf 16. http://www.porkboard.org/docs/PRRSchapter7.pdf 17. http://www.porkboard.org/docs/PRRSchapter1.pdf 18.http://www.porkboard.org/docs/PRRSchapter2.pdf 19.http://www.porkboard.org/docs/PRRSchapter3.pdf 20.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi
PHỤ LỤC
Chuẩn bị môi trƣờng không có RNase và RNA
Khi làm việc với RNA, cần phải cẩn thận nhằm tạo ra một môi trường không có RNase. Ribonuclease tồn tại ở khắp nơi. RNase rất bền vững và khó bị bất hoạt. Để thành công, cần phải duy trì một môi trường không có RNase trước và trong khi thực hiện các thao tác tinh sạch và các phân tích sau đó. Sau đây là một số chú ý và kỹ thuật cần ghi nhớ khi làm việc với RNA:
1. Nguồn lây nhiễm RNA thông thường là RNA của da, vi khuẩn và nấm, chúng hiện diện rất nhiều trong bụi và trên các thiết bị. Để ngăn chặn sự nhiễm RNA cần phải mang găng tay trong suốt thời gian làm thí nghiệm và sử dụng các thiết bị vô trùng khi thực hiện các thao tác chiết tách hay phân tích.
2. Sử dụng các thiết bị vô trùng và chỉ sử dụng một lần. Những vật liệu này đòi hỏi phải sạch RNA.
3. Cần xử lý sạch RNA cho các dụng cụ trước khi thực hiện thao tác. Thông qua việc rửa các vật liệu bằng nhựa bằng 0.1N NaOH/1mM EDTA và sau đó với nước đã được xử lý với DEPC (Diethyl pyrocarbonate). Những công cụ này cần được sử lý sạch RNase bằng cách ngâm với nước DEPC 0.005% và gia nhiệt bằng cách sấy.
4. Nước cất hai lần khử ion cần được xử lý để đảm bảo không có sự hiện diện của RNase. Có thể kiểm tra điều này bằng cách ủ RNA trong nước mong muốn và sau đó kiểm tra bằng cách điện di.
5. Tất cả các dụng cụ và hoá chất thao tác trên RNA cần được dùng riêng.
6. Việc hấp riêng không có ý nghĩa để bất hoạt RNase. Tất cả các dung dịch trong phòng thí nghiệm đều cần phải được xử lý với DEPC 0.05% bằng cách ủ qua đêm. Tất cả các dịch trên cần phải được hấp trong 30 phút. Thêm nữa là không được sử dụng DEPC chung với những dung dịch đệm có Tris.
Duy trì điều kiện không có RNase trong phản ứng
Recombinant Rnasin(a,b) giúp giữ RNA không bị thoái hoá bằng cách ức chế một vài RNase mà không gây trở ngại cho các phản ứng về sau. Bảo vệ RNA trong phản ứng là một điều kiện cho sự thành công của thí nghiệm. RNase inhibitors là một công cụ rất mạnh trong việc duy trì một môi trường không có RNase. Để đảm bảo sự thành công RNase inhibitor cần không gây trở ngại cho các enzyme trong phản ứng. Rnasin® cần sử dụng với tỉ lệ 1:1 với RNase. Những kháng thể ức chế khác có lẽ hiện diện với một tỉ lệ quá nhỏ không đủ sức bảo vệ RNA trong phản ứng.
Chuẩn bị hóa chất cho điện diRNA
Deionize formamide: Cho Dowex® XG8 mixed-bed resin vào formamide và khuấy trộn trong nhiệt độ phòng trong khoảng 1 giờ. Sau đó lọc hai lần bằng giấy lọc Whatman®. Chia nhỏ ra và trữ lạnh ở -700C. 5X MOPS buffer - 10mM MOPS - 2,5 mM sobium acetate - 0,5 mM EDTA - pH 7.0
Ta tiến hành quá trình pha MOPS Buffer 5X như sau: + Chẩn bị chai khoảng 1lít
+ Cho vào đó 500 ml nước cất hai lần khử ion và đã được xử lý với DEPC. + Tiếp tục cho vào 12,5g MOPS
+ Tiếp tục cho vào 1,229g sodium acetate
+ Tiến hành lắc đều cho đến khi các hoá chất trong chai tan hết. + Tiếp tục cho vào chai 6ml EDTA (5,972ml)
+ Điều chỉnh đến pH = 7.0 với NaOH 10N
+ Tiếp tục cho nước cất hai lần khử Ion và đã được xử lý với DEPC vào để đạt thể tích là 600ml.
+ Chia nhỏ ra mỗi 200ml và tiến hành hấp khử trùng. Quá trình này có thể làm cho dung dịch buffer chuyển sang màu vàng nhưng điều này không ảnh hưởng đến chất lượng buffer.
Pha 500ml buffer điện di như sau
+ Chẩn bị 100ml 5X dung dịch MOPS + Cho thêm 2 ml formaldehyde 37 – 40%
+ Thêm nước đã khử DEPC cho đến khi đạt thể tích 500ml Chẩn bị buffer biến tính và đặt mẫu
Pha 1ml dung dịch 2X này như sau:
+ Cho 149,2 ml bromophenol blue 0,67% vào eppendorf 1,5 ml + Cho thêm 1,6 μl EDTA 1M
+ Thêm 80 μl glycerol 100% + Thêm 29,2 μl formol 37 – 40% + Thêm 121,2 μl formamide
+ Thêm 618,4 μl dung dịch MOPS 2,6 X
Quy trình ly trích RNA theo bộ kít QIAamp
Ổn định mẫu ở điều kiện nhiệt độ phòng (15 – 250
C) Ổn định buffer ở nhiệt độ phòng.
Kiểm tra buffer AW1 và AW2 đã pha và để ổn định ở nhiệt độ phòng.
Hoà tan lại khối kết tủa Buffer AVL/Carrier RNA bằng nhiệt nếu cần thiết và giữ ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
Tất cả các bước ly tâm đều thực hiện ở nhiệt độ phòng.
Bước 1: Cho 560 µl Buffer AVL có chứa Carrier RNA vào một tube 1.5 ml.
Bước 2: Cho 140 µl mẫu vào tube có chứa buffer ở trên. Vortex nhẹ để trộn đều trong