Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của phản ứng PCR như: nồng độ dung dịch mẫu, nồng độ Mg++, chu trình nhiệt ... và đặc biệt là nhiệt độ gắn mồi. Thông thường, ở nhiệt độ càng cao thì mức độ đặc hiệu càng tăng vì tránh được hiện tượng nhiễm các nguồn gen lạ. Ở thí nghiệm này chúng tôi tiến hành phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu với các thành phần phản ứng và chu trình nhiệt được trình bày ở bảng 2.5 và hình 2.1 trên dải nhiệt độ từ 550C đến 640C nhằm tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp của các mồi.
Các đoạn promoter được tiến hành khuếch đại theo phương pháp PCR. Khi sử dụng các cặp mồi CADpro1 và CADpro2 để khuếch đại hai đoạn trình tự của promoter EuCAD. Các đoạn promoter CAD 1 và 2 được nhân bản bằng việc sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu thiết kế dựa trên trình tự nucleotide của promoter của gen CAD ở cây bạch đàn gunnii do vậy chúng tôi đã tiến hành phản ứng PCR với việc sử dụng dải nhiệt độ khác nhau. Sản phẩm PCR được điện di trên gel 0.8%, kết quả điện di thể hiện trong hình 3.2 và hình 3.3:
Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1
Giếng M: Thang DNA 1 kb; Giếng 55 – 64: Nhiệt độ gắn mồi (o
Do việc khuếch đại đoạn promoter của cây bạch đàn urô được thực hiện sử dụng cặp mồi thiết kế dựa trên trình tự đã công bố của cây bạch đàn E.
gunnii, vì vậy trên hình ảnh điện di ngoài các băng vạch có kích thước đúng
như dự đoán khoảng 987 bp còn thấy xuất hiện các băng vạch không đặc hiệu. Trong thí nghiệm này chúng tôi lựa chọn các băng vạch có kích thước đúng theo tính toán lý thuyết khoảng 987 bp làm vật liệu cho các thí nghiệm tiếp theo. Kết quả nhân bản tốt nhất tương ứng với băng vạch đậm nhất có nhiệt độ bắt mồi là 55o
C.
Hình 3.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2
Giếng M: Thang DNA 1 kb; Giếng 53 – 60: Nhiệt độ gắn mồi (o
C)
Kết quả điện di trên hình 3.3 cho thấy trên bản điện di ngoài các băng vạch đúng như kích thước dự đoán khoảng 1149 bp còn xuất hiện các băng vạch không đặc hiệu là do việc khuếch đại đoạn promoter của cây bach đàn urô được thực hiện sử dụng cặp mồi thiết kế dựa trên trình tự đã công bố của cây bạch đàn E. gunnii, trong thí nghiệm này chúng tôi lựa chọn các băng vạch đúng theo tính toán lý thuyết làm vật liêu cho các thí nghiệm tiếp theo. Từ hình ảnh điện di cho thấy các băng vạch đậm nhạt ứng với các nhiệt độ khác nhau, nhiệt độ càng cao sự bắt cặp giữa mồi và đoạn DNA càng đặc hiệu, băng vạch càng rõ nét. Băng vạch rõ nét nhất ứng với nhiệt độ gắn mồi là 59o
3.3. Tách dòng và xác định trình tự đoạn promoter EuCAD
3.3.1. Tinh sạch sản phẩm PCR và tạo vector tái tổ hợp
Quá trình tách dòng được thực hiện bằng cách lai sản phẩm PCR vào vector tách dòng pBT (hình 2.2) do Phòng công nghệ tế bào thực vật - Viện công nghệ sinh học cung cấp đây là vector được cải tiến từ pUC18. Để việc lai sản phẩm PCR và vector tách dòng tạo vector tái tổ hợp có chứa đoạn promoter EuCAD có hiệu suất cao thì đoạn PCR chỉ thu 1 băng duy nhất và phải được loại bỏ các thành phần tạp chất trong sản phẩm PCR như mồi, đệm, dNTPs… bởi các muối có trong đệm PCR sẽ làm ảnh hưởng đến nồng độ đệm thích hợp cho enzyme thực hiện phản ứng lai. Các băng DNA sản phẩm phụ của PCR có thể ảnh hưởng tới việc chọn dòng sau này. Tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng bộ Kit QIAquick Extraction, sản phẩm sau khi tinh sạch được điện di trên gel 0.8%. Kết quả điện di sản phẩm PCR sau khi tinh sạch trên hình 3.4 và 3.5 cho thấy có thể tiến hành phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng tiếp theo.
Hình 3.4: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 sau tinh sạch
Giếng M: Thang DNA 1 kb; Giếng 1: Đoạn DNA sau tinh sạch
Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 sau tinh sạch
Giếng M: Thang DNA 1 kb; Giếng 1: Đoạn DNA sau tinh sạch
Phản ứng ghép nối là phản ứng hình thành liên kết phosphodiester giữa base Adenin ở đầu 5’ của sản phẩm PCR với base Thymine ở đầu 3’ của vector tách dòng nhờ hoạt tính nối của enzyme T4 ligase được thực hiện như mục 2.3.6.1. Kết quả ghép nối được thể hiện ở sản phẩm biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH5.
3.3.2. Biến nạp sản phẩm ligation vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5.
Sản phẩm thu được sau khi ghép nối được biến nạp vào tế bào khả biến
E.coli DH5 sau đó được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung
ampicillin 100mg/l, X-gal 0.004% và IPTG 100M. Hiệu suất ở bước biến nạp phụ thuộc vào hai yếu tố:
Thứ nhất là sản phẩm PCR phải tinh sạch và đặc hiệu.
Thứ hai là tế bào khả biến phải được chuẩn bị tốt.
Hình 3.6: Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến
Kết quả hình 3.6 cho thấy đã thu được một số lượng lớn dòng các khuẩn lạc xanh trắng trên môi trường LB. Các tế bào có mang plasmid có chứa gen kháng kháng sinh có thể phát triển được trên môi trường chọn lọc này và phát
triển thành các khuẩn lạc. Những khuẩn lạc xanh xuất hiện là do vector không có đoạn gen ngoại lai nào chèn vào mà do vector tự đóng vòng. Do vector có mang operon lacZ nên khi operon này hoạt động bình thường và có cảm ứng IPTG sẽ tổng hợp enzyme -galactosidase, enzyme này sẽ chuyển hóa cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh. Còn những khuẩn lạc trắng có thể là do nhận được plasmid mang operon không hoạt động. Do đó, khi có chất cảm ứng IPTG thì gen không tổng hợp enzyme -galactosidase và không xảy ra sự chuyển hóa X-gal. Lac operon mất hoạt động là do đoạn DNA ngoại lai xen vào giữa promoter của operon lacZ. Do đó, lac-promoter không thể điều khiển gen cấu trúc phiên mã, nên không thể dịch mã thành enzyme được. Tuy nhiên không phải tất cả các khuẩn lạc trắng đều mang plasmid tái tổ hợp có chứa đoạn promoter CAD1 và CAD2 có thể là chứa đoạn gen là sản phẩm phụ của phản ứng PCR, sự đột biến trên promoter lac hay sự đứt gãy base thymine đầu 3’ của vector cũng có thể làm cho khuẩn lạc mang màu trắng. Vì vậy các khuẩn lạc trắng mang plasmid tái tổ hợp được chọn lọc bằng phương pháp colony-PCR để phục vụ cho bước tiếp theo.
3.3.3. Chọn dòng tế bào E.coli mang vector tái tổ hợp
Để chắc chắn rằng các đoạn promoter CAD1 và CAD2 có mặt trong các dòng khuẩn lạc thu được chúng tôi tiến hành phản ứng colony-PCR. Phương pháp này giúp chúng ta phát hiện nhanh những dòng khuẩn lạc nào mang gen mục tiêu, giảm chi phí và tiết kiệm thời gian. Tiến hành phản ứng với 11 khuẩn lạc trắng cho mỗi đĩa khuẩn lạc, sau đó thực hiện phản ứng colony- PCR với các cặp mồi pUC18F1 và pUC18R1 để chọn dòng khuẩn lạc mang đoạn promoter CAD1 và CAD2. Sở dĩ trong thí nghiệm này chúng tôi không dùng các cặp mồi CADpro1 và CADpro2 là do khi thực hiện phản ứng ghép nối sản phẩm PCR được sử dụng với một lượng lớn. Ngoài những đoạn DNA quan tâm đã được gắn vào vector còn có rất nhiều đoạn DNA còn dư thừa, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
chúng tồn tại bên trong hoặc xung quanh các khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch khi biến nạp. Vì vậy khi thực hiện phản ứng colony-PCR với các cặp mồi CADpro1 và CADpro2 thì chúng ta vẫn có thể thu được các băng vạch có kích thước mong muốn tuy nhiên trên thực tế các đoạn promoter CAD1 và CAD2 có thể chưa được gắn vào vector. Mồi pUC18 được thiết kế nằm trên vector pBT và ở hai phía đối với đoạn cắt đa điểm. Khoảng cách giữa hai mồi trên vector này khoảng 200bp. Do đó khi tiến hành phản ứng colony-PCR thì đối với các khuẩn lạc trắng do vector tự đóng vòng thì sẽ thu được băng có kích thước khoảng 200bp, còn với plasmid tái tổ hợp sẽ chứa các đoạn chèn có kích thước thực tế bằng kích thước băng điện di trừ đi 200 bp (kích thước đoạn nằm trên vector). Sản phẩm colony-PCR được điện di trên gel 0,8%, kết quả điện di được thể hiện trên hình 3.7:
Hình 3.7: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc
Giếng M: Thang DNA 1 kb; Giếng 1 – 11: Các dòng khuẩn lạc
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR trên hình 3.7 cho thấy có 10 dòng khuẩn lạc cho kết quả dương tính, các mẫu đều có băng duy nhất kích thước khoảng 1187 bp kết quả này phù hợp với kích thước dự tính và có 1 dòng khuẩn lạc âm tính, như vậy hiệu suất biến nạp là khá cao. Như vậy, kết quả bước đầu đã chọn được dòng plasmid mang đoạn promoter CAD1 tái tổ
hợp. Các dòng mang plasmid có đoạn promoter CAD1 được nhân lên để tách plasmid.
Cũng làm tương tự với đĩa khuẩn chứa đoạn promoter CAD2 :
Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc
Giếng M: Thang DNA 1 kb; Giếng 1 – 11: Các dòng khuẩn lạc
Kết quả điện di trên hình 3.8 cho thấy dòng khuẩn lạc số 6 xuất hiện băng DNA có kích thước vào khoảng 1349 bp đúng với kích thước đã tính toán. Như vậy bước đầu khẳng định dòng khuẩn lạc số 6 mang plasmid tái tổ hợp có chứa đoạn promoter CAD2.
Từ kết quả thu được chúng tôi tiến hành nuôi khuẩn trên môi trường LB lỏng và tách plasmid.
3.3.4. Tách chiết plasmid tái tổ hợp
10 dòng khuẩn lạc chứa đoạn promoter CAD1 và 1 khuẩn lạc chứa đoạn promoter CAD2 được lựa chọn sau đó nuôi trong môi trường LB lỏng và tách plasmid, đây là phương pháp khá đơn giản nhưng có độ tinh sạch khá cao. Plasmid được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di plasmid tinh sạch được trình bày trên hình 3.9:
Hình 3.9: Ảnh điện di plasmid tái tổ hợp tách từ tế bào E.coli DH5α
Giếng M: Thang DNA 1 kb; Giếng 1 – 10: Các dòng khuẩn lạc
Kết quả điện di trên hình 3.9 cho thấy các plasmid tái tổ hợp đều có 3 băng rõ nét và không bị đứt gãy. Để kiểm tra sự có mặt của các đoạn promoter CAD1 và CAD2 trong các plasmid tái tổ hợp chúng tôi tiến hành xử lý plasmid thu được bằng enzyme cắt giới hạn BamHI.
Kiểm tra sự có mặt của promoter trong plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn: Theo lý thuyết trong sản phẩm thu được sẽ có hai phân đoạn DNA:
Thứ nhất là đoạn promoter CAD1, CAD2 cần chèn.
Thứ hai là vector pBT.
Kết quả điện di sản phẩm cắt được thể hiện trên hình 3.10 và 3.11:
Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter CAD1
Kết quả điện di như hình 3.10 cho thấy sản phẩm cắt phân thành hai băng tương ứng với phần vector pBT có kích thước 2705 bp và đoạn promoter CAD1 khoảng 987 bp. Như vậy có thể bước đầu kết luận chúng tôi đã thu được dòng khuẩn có chứa plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter CAD1. Để chắc chắn đây có phải là chính xác đoạn promoter CAD1 mong muốn, chúng tôi lựa chọn plasmid tách từ dòng số 9 để xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM®
3100 Avant Genetic Analyzer.
Hình 3.11: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter CAD2
Giếng M : DNA 1 kb; Giếng 1 : plasmid tách từ dòng số 6; (+) : Sản phẩm colony-PCR từ dòng số 6
Kết quả điện di như hình 3.11 cho thấy sản phẩm cắt phân thành hai băng rõ nét tương ứng với phần vector pBT khoảng 2705 bp và đoạn promoter CAD2 khoảng 1149 bp. Như vậy có thể có thể bước đầu khẳng định chúng tôi đã tạo được dòng khuẩn có chứa plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter CAD2. Để chắc chắn đây chính xác là đoạn promoter mong muốn, chúng tôi đã mang dòng khuẩn số 6 đi đọc trình tự.