Reaction)
Kỹ thuật PCR (hay còn gọi là kỹ thuật nhân bản gen in vitro), do Kary Mullis và đtg phát minh vào năm 1985, đƣợc xem là một phát minh có tính đột phá lớn, tạo ra một cuộc đại cách mạng trong lĩnh vực nghiên cứu sinh học phân tử. PCR đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu nhân dòng gen, các phân tích cận lâm sàng cũng nhƣ trong nghiên cứu phân loại học phân tử.
Nguyên tắc:
Kỹ thuật PCR phối hợp khả năng lai đặc hiệu của DNA và khả năng tổng hợp DNA in vitro của enzyme DNA polymerase để nhân bản in vitro các đoạn gen lên hàng triệu lần qua một loạt các chu kỳ lặp lại [1], [13].
Tuy nhiên, do enzyme DNA polymerase hoạt động cần các mồi (primer) nên ngƣời ta phải biết đƣợc các trình tự nucleotide ở hai đầu DNA để thiết kế các cặp mồi đặc hiệu. Trong điều kiện thích hợp và môi trƣờng có chứa các nucleotide tự do, enzyme sẽ kéo dài đoạn mồi thành sợi bổ sung với sợi làm khuôn [1], [13].
Thành phần phản ứng PCR:
- Phân tử DNA có chứa đoạn DNA cần nhân bản và chỉ cần biết trình tự nucleotide của đoạn nhỏ nằm cạnh đoạn cần nhân để thiết kế hai mồi oligonucleotide.
- Hai đoạn mồi ngắn để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp DNA. Đây là tín hiệu chỉ hƣớng đi (5’ - 3’) của enzyme DNA - polymerase. Mồi dài khoảng 20 nucleotide và các nucleotide ở hai đầu của mồi không tự kết hợp với nhau theo nguyên tắc bổ sung.
- Dung dịch đệm cung cấp ion Mg2+ và nƣớc tinh khiết không có enzyme RNase và DNase.
- Enzyme chịu nhiệt Taq polymerase [1], [13].
Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR khoảng từ 20 - 50 µl.
Các giai đoạn:
Phản ứng PCR gồm một loạt chu kỳ lặp lại của ba giai đoạn cơ bản sau đây [1], [13]:
- Giai đoạn biến tính DNA bằng nhiệt: tách sợi DNA kép thành dạng sợi đơn (single strands). Tất cả các phản ứng enzyme (phản ứng tổng hợp DNA từ chu kỳ trƣớc đó) trong giai đoạn này đều bị dừng lại. Mỗi sợi đơn sau đó sẽ trở thành một sợi khuôn cho mồi bám vào.
Nhiệt độ: 94 - 95o
C, tại nhiệt độ này các phân tử DNA mạch kép bị tách ra do sự đứt gãy của các liên kết hydro.
Thời gian: khoảng 1 phút
- Giai đoạn gắn mồi: thực hiện phản ứng lai giữa mồi và DNA khuôn. Các mồi đƣợc gắn vào vị trí có trình tự tƣơng đồng ở DNA khuôn mẫu, mồi bị lắc nhẹ chung quanh do chuyển động Brown vì thế các liên kết ion đƣợc tạo thành và đứt gãy liên tục giữa mồi sợi đơn và DNA khuôn sợi đơn. Các liên kết ion ổn định hơn tạo thành một đoạn nhỏ (các mồi đã lắp ráp chính xác) và trên các đoạn nhỏ DNA sợi đôi đó (DNA khuôn và mồi) Taq
polymerase có thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu.
Nhiệt độ: ở giai đoạn này phạm vi nhiệt độ đƣợc sử dụng có thể rất rộng tuỳ thuộc vào trình tự nucleotide của mồi, thông thƣờng khoảng 55o
C, nhƣng có khi chỉ 35oC hoặc đôi lúc lên đến 68o
C.
Thời gian: 20 giây đến 2 phút
- Giai đoạn kéo dài: nhiệt độ lúc này đƣợc nâng lên đến 72oC, đây là nhiệt độ tối thích cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA bằng cách bổ
sung các dNTP bắt đầu từ các vị trí có mồi gắn vào theo chiều 5’ - 3’. Ở nhiệt độ này, các mồi bắt cặp chính xác không bị rời khỏi DNA khuôn mẫu do có các mối liên kết ion mạnh hơn lực phá vỡ liên kết, trong khi đó các mồi ở các vị trí bắt cặp không chính xác sẽ bị rời ra khỏi khuôn (do nhiệt độ cao) do đó không tổng hợp đƣợc DNA từ những mồi này. Thời gian của giai đoạn này từ 30 giây đến vài phút, tuỳ thuộc chiều dài đoạn DNA cần nhân bản.
Kết thúc một chu kỳ từ một DNA kép ban đầu tổng hợp đƣợc 2 sợi DNA kép mới. Cứ nhƣ vậy, phản ứng xảy ra trong 25 - 40 chu kỳ. Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ đƣợc duy trì ở 72oC trong khoảng từ 5 - 10 phút sao cho tất cả các phản ứng enzyme diễn ra hoàn toàn. Sau đó nhiệt độ đƣợc hạ xuống 4oC để bảo quản sản phẩm.
Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agarose nồng độ từ 0,8 - 2 %.
Hiện nay, kỹ thuật PCR đã đƣợc phát triển, cải tiến so với ban đầu. Ngƣời ta đƣa vào thêm một số bƣớc phụ nhƣ khởi động nóng nhằm làm sợi DNA kép biến tính hoàn toàn, kéo dài thời gian tổng hợp chuỗi ở chu kì cuối cùng và giữ mẫu ở 4o
C.