thuật RAPD
3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA từ lá các mẫu dẻ
DNA được tách chiết và tinh sạch. Sau đó, kiểm tra độ tinh sạch và xác định hàm lượng thông qua máy đo quang phổ hấp thụ ở các bước sóng 260nm và 280nm. Đồng thời, các mẫu DNA cũng được điện di trên gel agarose 0,8% để đánh giá độ tinh sạch và chất lượng DNA. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.1 và hình 3.1.
Bảng 3.1. Hàm lượng và độ tinh sạch DNA của 5 mẫu dẻ nghiên cứu
Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số của các mẫu dẻ trên gel agarose 0,8% Kết quả ở bảng 3.1 và hình 3.1 cho thấy, DNA được tách từ các mẫu lá dẻ có hàm lượng dao động từ 798,8µg/ml đến 1143,7µg/ml, băng vạch sắc nét, không bị đứt gãy. Độ tinh sạch thể hiện ở tỉ lệ OD260/OD280 đạt từ 1,79 -
Tên mẫu Hàm lượng DNA (μg/ml) Tỉ số OD 260/280
TK1 789,8 1,87 TK2 852,5 1,83 TK3 1143,7 1,92 BG 954,3 1,79 TQ 887,5 1,86 TK1 TK2 TK3 BG TQ
1,92. Như vậy, chất lượng DNA đảm bảo tiêu chuẩn để tiến hành các phản ứng PCR - RAPD.
3.1.2. Kết quả phân tích điện di sản phẩm PCR - RAPD
Sau khi tách chiết, tinh sạch và pha về nồng độ chuẩn cho các phản ứng PCR, DNA của 5 mẫu dẻ đã được phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên. Đánh giá tính đa hình thông qua giá trị PIC, khoảng cách di truyền được xác định thông qua hệ số tương đồng và biểu đồ hình cây.
Sản phẩm RAPD với các mồi khác nhau được điện di trên gel agarose 1,8% để phân tích tính đa hình DNA của 5 mẫu dẻ nghiên cứu. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên có kí hiệu là DTN1, DTN2, OPM5, APR08, OCN6, TN03, TN07, DTN5, OPQ02, DHN04 để phân tích mối quan hệ di truyền giữa các mẫu dẻ.
Bảng 3.2. Đa hình về phân đoạn DNA được nhân bản của 10 mồi ngẫu nhiên
Tên mồi Số phân đoạn
DNA Số phân đoạn đa hình Số phân đoạn đơn hình % phân đoạn đa hình DTN1 6 2 4 33,3 DTN2 7 5 2 71,4 OPM5 5 2 3 40,0 PR08 5 2 3 40,0 OCN6 4 3 1 75,0 TN03 6 0 6 0,0 TN07 3 0 3 0,0 DTN5 3 0 3 0,0 OPQ02 2 0 2 0,0 DHN04 5 0 5 0,0 Tổng số 46 14 32 30,4
Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện các phân đoạn khi so sánh giữa các mẫu dẻ khác nhau trong cùng 1 mồi. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.2.
Như vậy, tổng số phân đoạn DNA của 5 mẫu lá dẻ khi phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên là 46 phân đoạn. Trong đó, chỉ có 14 phân đoạn cho tính đa hình (chiếm 30,4%) và không cho đa hình là 32 phân đoạn (chiếm 69,6%).
Trong số 10 mồi nghiên cứu, có tới 5 mồi không cho tính đa hình các phân đoạn DNA. Mức độ đa hình của các mồi dao động từ 33,3% - 75,0% (mồi OCN6 cho tính đa hình cao nhất và thấp nhất là mồi DTN1). Năm mồi còn lại là TN03, TN07, DTN5, OPQ02 và DHN04 không cho tính đa hình (0%).
Giá trị PIC được sử dụng khi phân tích hàm lượng thông tin đa hình, kết quả được thể hiện ở bảng 3.3. Số liệu bảng 3.3 phù hợp với tỉ lệ đa hình của các phân đoạn DNA được nhân bản (bảng 3.2). Cụ thể, giá trị PIC của các mồi TN03, TN07, DTN5, OPQ02 và DHN04 là 0 (không đa hình) và giá trị PIC của mồi OCN6 là 0,57 (đa hình cao nhất). Tuy nhiên, giá trị PIC không chỉ liên quan tới tỉ lệ phân đoạn DNA đa hình mà còn cho biết số lượng cá thể cùng xuất hiện phân đoạn đa hình lớn hay nhỏ (bảng 3.3).
Bảng 3.3: Hàm lượng thông tin tính đa hình (PIC) của 5 mẫu dẻ
STT Tên mồi Giá trị PIC STT Tên mồi Giá trị PIC 1 DTN1 0,32 6 TN03 0,00 2 DTN2 0,34 7 TN07 0,00 3 OPM5 0,38 8 DTN5 0,00 4 APR08 0,36 9 OPQ02 0,00 5 OCN6 0,57 10 DHN04 0,00
Với 10 mồi ngẫu nhiên được sử dụng cho 5 mẫu dẻ khác nhau cho thấy, có 5 mồi thể hiện sự sai khác về các phân đoạn DNA được nhân bản, 5 mồi
còn lại không có sự sai khác về các phân đoạn DNA được nhân bản giữa các đối tượng nghiên cứu. Giá trị PIC dao động từ 0,32 đến 0,57. Như vậy, với 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu đã đưa ra được sự khác nhau về độ tương đồng các phân đoạn DNA của 5 mẫu dẻ phân bố ở các khu vực địa lý khác nhau là Trùng Khánh - Cao Bằng, Yên Thế - Bắc Giang và Vân Nam - Trung Quốc.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR-RAPD trên gel agarose 1,8% của 4 mồi DTN1, DTN2, OPM5 và TN03 được thể hiện dưới đây:
Mồi TN03: Trong phạm vi vùng phân tích, thu được tổng số 30 phân đoạn DNA với kích thước nằm trong khoảng 200bp - 2000bp, (mỗi mẫu dẻ nghiên cứu đều thu được 6 phân đoạn DNA). Các phân đoạn DNA được nhân bản của các mẫu dẻ có kích thước hoàn toàn giống nhau (hình 3.2A). Như vậy, sử dụng mồi TN03 không phát hiện được sự sai khác về các phân đoạn DNA đa hình được nhân bản.
TK1TK2 TK3 BG TQ M TK1 TK2 TK3 BG TQ M
TN03 DTN2
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 5 mẫu dẻ với mồi TN03 và DTN2 ←1000bp ←250bp ←250bp ←1000bp ←500bp ←20000bp ←500bp A B
Mồi DTN2: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR với mồi DTN2 thu được tổng số phân đoạn DNA của 5 mẫu dẻ là 27 phân đoạn. Kích thước các phân đoạn DNA thu được dao động trong khoảng 200bp - 1000bp. Trong đó, xuất hiện 5 phân đoạn DNA khác nhau giữa các mẫu nghiên cứu. Cụ thể, ở kích thước khoảng 600bp, mẫu dẻ BG có phân đoạn DNA được nhân bản các mẫu còn lại không xuất hiện phân đoạn này. Ngược lại, ở kích thước khoảng 200bp và 750bp, bốn mẫu còn lại đều có phân đoạn DNA xuất hiện, trong khi đó mẫu dẻ BG không xuất hiện các phân đoạn DNA có kích thước trên (hình 3.2B).
Mồi DTN1: Trên phạm vi vùng phân tích thu được 22 phân đoạn DNA (thuộc 6 phân đoạn). Kích thước các phân đoạn dao động trong khoảng 250bp - 1500bp. Trong số 6 phân đoạn xuất hiện trên bảng điện di, có 4 phân đoạn hoàn toàn giống nhau giữa các mẫu nghiên cứu nằm trong khoảng kích thước 750bp - 1500bp. Mẫu dẻ Bắc Giang có 2 phân đoạn DNA được nhân bản với kích thước khoảng 250bp và 500bp nhưng các mẫu còn lại không xuất hiện phân đoạn này (hình 3.3A).
TK1 TK2 TK3 BG TQ M TK1 TK2 TK3 BG TQ M (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
DTN1 OPM05
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 5 mẫu dẻ với mồi DTN1 và OPM5
←250bp ←500bp ←1500bp ←1000bp ←250bp A B
Mồi OPM5: Tổng số có 5 phân đoạn DNA xuất hiện và có hai phân đoạn DNA thể hiện sai khác giữa các mẫu nghiên cứu. Kích thước các phân đoạn được nhân bản dao động từ 200bp - 1000bp. Ở kích thước 200bp và 1000bp, mẫu Bắc Giang tiếp tục xuất hiện phân đoạn DNA được nhân bản. Tuy nhiên, bốn mẫu còn lại không thu được hai phân đoạn này. Ở phạm vi kích thước 500bp - 800bp, cả 5 mẫu đều nhân được 3 phân đoạn DNA như nhau (hình 3.3B).
Như vậy, điện di sản phẩm PCR-RAPD trên gel agarose 1,8% đã khẳng định sự khác biệt về phân đoạn DNA được nhân bản của mẫu dẻ Bắc Giang so với bốn mẫu dẻ ở Trùng Khánh và Trung Quốc.
3.1.3. Mối quan hệ di truyền của các mẫu dẻ nghiên cứu
Các số liệu PCR - RAPD được xử lý và phân tích trong chương trình NTSYSpc version 2.0 nhằm tìm ra khoảng cách di truyền giữa các mẫu dẻ nghiên cứu thông qua hệ số tương đồng di truyền và biểu đồ hình cây.
Để kiểm tra phương pháp phân nhóm, chúng tôi đã tiến hành xác định giá trị tương quan kiểu hình theo ba phương pháp tính hệ số di truyền giống nhau (phương pháp của Jaccard, của Nei & Li, của Sokal) với bốn kiểu phân nhóm (WPGMA, UPGMA, liên kết hoàn toàn và liên kết đơn lẻ) (bảng 3.4). Biểu đồ hình cây được thiết lập dựa trên giá trị tương quan cao nhất với các giá trị khi r 0,9: tương quan rất chặt, r = 0,8 - 0,9: tương quan chặt, r = 0,7 - 0,8: tương quan tương đối chặt, r 0,7: tương quan không chặt.
Bảng 3.4 cho thấy, với ba cách tính hệ số di truyền giống nhau và bốn kiểu phân nhóm phản ánh mối tương quan kiểu hình của 5 mẫu dẻ dao động rất chặt 0,99878 - 0,99943. Trong đó, giá trị tương quan kiểu hình (r) lớn nhất 0,99943 khi tính theo hệ số di truyển Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA. Vì vậy, sơ đồ hình cây được thiết lập theo hệ số di truyền giống nhau Jaccard và
Bảng 3.4. Giá trị tương quan kiểu hình (r) theo 3 cách tính về hệ số tương đồng
Phương pháp
Kiểu phân nhóm UPGMA WPGMA Liên kết
hoàn toàn Liên kết đơn lẻ SM 0,99911 0,99911 0,99911 0,99911 Dice 0,99879 0,99879 0,99879 0,99878 Jaccard 0,99943 0,99910 0,99910 0,99909
Kết quả bảng 3.5 cho thấy, 3 mẫu dẻ TK1, TK2 và TK3 thu ở các khu vực khác nhau ở huyện Trùng Khánh - Cao Bằng có mức độ tương đồng đạt 100% khi phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên. Điều này cho thấy, các mẫu dẻ TK có độ thuần và độ đồng nhất rất cao.
Bảng 3.5. Hệ số tương đồng giữa các mẫu dẻ nghiên cứu
TK1 TK2 TK3 BG TQ TK1 1,00000 TK2 1,00000 1,00000 TK3 1,00000 1,00000 1,00000 BG 0,69565 0,69565 0,69565 1,00000 TQ 1,00000 1,00000 1,00000 0,69565 1,00000
Kết quả ở bảng 3.5 cũng cho thấy mức độ gần gũi di truyền của các mẫu dẻ Trùng Khánh và Trung Quốc. Bốn mẫu TK1, TK2, TK3 và TQ không xuất hiện sự khác biệt. Các phân đoạn DNA được nhân lên của bốn mẫu trên với các mồi nghiên cứu không có sự sai khác. Mẫu dẻ Bắc Giang có mức độ tương đồng DNA thấp so với các mẫu dẻ từ Vân Nam - Trung Quốc và Trùng Khánh - Cao Bằng. Hệ số tương đồng giữa mẫu dẻ Bắc Giang với các mẫu còn lại đạt 69,6% (sai khác tới 30,4%). Sự sai khác DNA của mẫu dẻ Bắc
Giang so với các mẫu còn lại nhận biết được do sự xuất hiện hay không xuất hiện phân đoạn DNA được nhân bản ở những kích thước nhất định.
Quan hệ di truyền của các mẫu dẻ nghiên cứu được thể hiện trên sơ đồ hình cây (hình 3.4) và được chia thành 2 nhánh:
- Nhánh I: Bao gồm duy nhất mẫu dẻ Bắc Giang, có sự sai khác so với 4 mẫu còn lại tới 30,4% (1- 0,696).
- Nhánh II: Bao gồm 4 mẫu dẻ TK1, TK2, TK3 và TQ. Các mẫu này không có sự sai khác di truyền. Như vậy, có thể nói 3 mẫu dẻ thu thập từ các vùng khác nhau ở Trùng Khánh - Cao Bằng và mẫu dẻ Vân Nam - Trung Quốc thuộc cùng 1 loài.
Kết quả này hoàn toàn phù hợp với hệ thống phân loại thực vật theo NguyễnTiến Bân (2003) [4]. Các mẫu dẻ Trùng Khánh và dẻ thu từ Vân Nam - Trung Quốc thuộc cùng loài Castanea molissima Blum (dẻ Trùng Khánh, dẻ Cao Bằng, dẻ Pố Tấu) thuộc chi CASTANEA Mill.1754 (Dẻ Trùng Khánh). Mẫu dẻ thu từ Bắc Giang thuộc loài Castanopsis boisii Hickel & Camus, 1992 (dẻ gai Yên Thế, dẻ gai Bắc Giang) trong chi CASTANOPSIS (D. Don) Spach, 1841, nom. Cons. (Dẻ gai, Cà ổi, Kha thụ) [4].
Nhánh II
Nhánh I
Hình 3.4. Biểu đồ hình cây các mẫu dẻ nghiên cứu theo hệ số của Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA
3.2. Kết quả nhân giống vô tính dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật
3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của cồn 70o và javen 65% đến khử trùng hạt trùng hạt
Dựa trên công thức khử trùng của một số cây , chúng tôi thử tìm môi trường và điề u kiện khử trùng thích hợp cho hạt dẻ Trùng Khánh . Hạt dẻ Trùng Khánh sau khi bóc hết 2 lớp vỏ cứng và vỏ gai được đem khử trùng trong cồn 70o (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
và javen 65% với các ngưỡng thời gian khác nhau. Hạt dẻ đã khử trùng được cấy vào môi trường WPM cơ bản, bổ sung nước dừa 200ml/l. Kết quả sau 4 tuần theo dõi được trình bày trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả khử trùng hạt dẻ Trùng Khánh Công thức Thời gian (phút) Tỉ lệ hạt sống không nhiễm (%) Tỉ lệ hạt nhiễm (%) Tỉ lệ hạt chết (%) Cồn 70o Javen 65% 1 2 25 31,67 55,00 13,33 2 5 25 35,00 46,67 18,33 3 7 25 63,33 20,00 16,67 4 10 25 55,00 21,67 23,33 5 2 20 28,33 56,67 15,00 6 5 20 30,00 58,33 11,67 7 7 20 25,00 56,67 18,33 8 10 20 26,67 35,00 38,33
Kết quả bảng 3.6 cho thấy, các công thức 4 và 8 có tỉ lệ hạt nhiễm thấp (dao động từ 21,67% đến 35%) nhưng tỉ lệ hạt chết lại khá cao (23,33% - 38,33%). Công thức 1, 2, 5, 6 cho tỉ lệ hạt chết thấp (từ 13,33% - 18,33%) nhưng tỉ lệ nhiễm lại khá cao (dao động từ 46,67% đến 58,33%). Ở công thức 7, tỉ lệ hạt nhiễm và chết đều cao nên tỉ lệ hạt sống không nhiễm thấp (25,00%) Hạt dẻ được khử trùng với cồn 70o
25 phút có tỉ lệ hạt nhiễm (20,00%) và tỉ lệ hạt chết (16,67%) đều không lớn lắm nên tạo được nhiều mẫu sạch nhất (63,33%).
Như vậy, theo nghiên cứu của chúng tôi, hạt dẻ Trùng Khánh được khử trùng với cồn 70o
trong 7 phút và javen 65% trong 25 phút là công thức thích hợp nhất.
A B C
D E
Hình 3.5. Các giai đoạn trong tạo nguyên liệu khởi đầu
A: Hạt dẻ chưa bóc vỏ B: Hạt dẻ đã bóc lớp vỏ cứng C: Hạt dẻ đã bóc lớp vỏ gai D: Hạt dẻ sau khử trùng E: Hạt dẻ sau khử trùng 2 tuần
3.2.2. Ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng nhân chồi của dẻ Trùng Khánh trong phòng thí nghiệm
3.2.2.1. Ảnh hƣởng riêng rẽ của BAP đến khả năng tạo chồi
Các cây con mọc từ hạt khi có kích thước 4cm - 7cm được cắt thành từng đoạn có kích thước 2cm - 3cm và đưa sang môi trường tạo chồi có thành phần: WPM + BAP (0,2mg/l; 0,5mg/l; 1mg/l; 1,2mg/l; 1,5mg/l) + đường sucrose 25g/l + agar 8,5g/l + nước dừa 200ml/l, pH = 5,7 - 5,8. Theo dõi sự
phát sinh chồi với các chỉ tiêu: tỉ lệ mô tạo chồi, số chồi/mô, chiều cao chồi và màu sắc chồi sau 2 và 4 tuần, chúng tôi thu được kết quả trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng phát sinh chồi
CT BAP (mg/l)
Tỉ lệ mô tạo chồi (%)
Số chồi/mô (chồi/mô)
Chiều cao chồi
(cm) Màu sắc chồi X ±mx % so với ĐC X±mx % so với ĐC X ±mx % so với ĐC Sau 2 tuần ĐC 0,0 44,44±0,18 100,00 1,25±0,25 100,00 0,91±0,17 100,00 XBT 1 0,2 55,56±0,18 125,02 1,33±0,21 106,67 1,29±0,09 141,76 XBT 2 0,5 100,00±0,00 225,02 1,44±0,18 115,56 1,24±0,11 136,26 XBT 3 1,0 88,89±0,11 200,02 1,38±0,18 114,29 1,06±0,14 116,48 XN 4 1,2 66,67±0,17 150,02 1,17±0,17 93,33 0,99±0,14 108,79 XBT 5 1,5 77,78±0,15 175,02 1,29±0,18 102,86 0,95±0,16 104,40 XBT Sau 4 tuần ĐC 0,0 55,56±0,18 100,00 1,25±0,25 100,00 1,83±0,22 100,00 XBT 1 0,2 66,67±0,17 134,00 1,50±0,22 120,00 2,53±0,27 138,43 XBT 2 0,5 100,00±0,00 200,00 1,56±0,18 124,44 2,83±0,24 154,64 XBT 3 1,0 88,89±0,11 178,00 1,43±0,20 110,00 2,23±0,25 121,71 XN 4 1,2 66,67±0,17 178,00 1,33±0,24 106,67 2,21±0,30 120,77 XBT 5 1,5 77,78±0,15 200,00 1,44±0,18 115,56 2,01±0,24 109,79 XBT
XBT: xanh bình thường; XN: xanh nhạt)
Kết quả bảng 3.7 cho thấy, tất cả các công thức bổ sung BAP với nồng độ khác nhau từ 0,2mg/l đến 1,5mg/l đều thấy có sự phát sinh chồi. Ở công thức bổ sung BAP với nồng độ 0,5mg/l cho tỉ lệ mô tạo chồi đạt kết quả cao
nhất (100%). Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến số chồi/mô và chiều cao chồi cho thấy, ở công thức không bổ sung BAP (ĐC) và bổ sung BAP với nồng độ thấp (0,2mg/l) cho số lượng chồi không cao (sau 4 tuần đạt 1,25 chồi/mô ở môi trường không bổ sung BAP và 1,50 chồi/mô ở môi trường bổ sung BAP 0,2mg/l). Khi bổ sung BAP với nồng độ cao hơn (1,0mg/l; 1,2mg/l và 1,5mg/l), số chồi/mô cũng không lớn (đạt 1,38; 1,33 và 1,44 chồi/mô sau 4 tuần). Riêng ở môi trường có bổ sung BAP với nồng độ 0,5mg/l số chồi/mô không lớn (1,44 chồi/mô sau 2 tuần và 1,56 chồi /mô sau 4 tuần) nhưng chiều cao chồi sau 4 tuần lại cho kết quả cao nhất, đạt 2,83cm (cao hơn 54,64% so với đối chứng).
A B
Hình 3.6: Ảnh hưởng của BAP đến sự tạo chồi (sau 4 tuần)