Sau khi tách chiết, tinh sạch và pha về nồng độ chuẩn cho các phản ứng PCR, DNA của 5 mẫu dẻ đã được phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên. Đánh giá tính đa hình thông qua giá trị PIC, khoảng cách di truyền được xác định thông qua hệ số tương đồng và biểu đồ hình cây.
Sản phẩm RAPD với các mồi khác nhau được điện di trên gel agarose 1,8% để phân tích tính đa hình DNA của 5 mẫu dẻ nghiên cứu. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên có kí hiệu là DTN1, DTN2, OPM5, APR08, OCN6, TN03, TN07, DTN5, OPQ02, DHN04 để phân tích mối quan hệ di truyền giữa các mẫu dẻ.
Bảng 3.2. Đa hình về phân đoạn DNA được nhân bản của 10 mồi ngẫu nhiên
Tên mồi Số phân đoạn
DNA Số phân đoạn đa hình Số phân đoạn đơn hình % phân đoạn đa hình DTN1 6 2 4 33,3 DTN2 7 5 2 71,4 OPM5 5 2 3 40,0 PR08 5 2 3 40,0 OCN6 4 3 1 75,0 TN03 6 0 6 0,0 TN07 3 0 3 0,0 DTN5 3 0 3 0,0 OPQ02 2 0 2 0,0 DHN04 5 0 5 0,0 Tổng số 46 14 32 30,4
Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện các phân đoạn khi so sánh giữa các mẫu dẻ khác nhau trong cùng 1 mồi. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.2.
Như vậy, tổng số phân đoạn DNA của 5 mẫu lá dẻ khi phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên là 46 phân đoạn. Trong đó, chỉ có 14 phân đoạn cho tính đa hình (chiếm 30,4%) và không cho đa hình là 32 phân đoạn (chiếm 69,6%).
Trong số 10 mồi nghiên cứu, có tới 5 mồi không cho tính đa hình các phân đoạn DNA. Mức độ đa hình của các mồi dao động từ 33,3% - 75,0% (mồi OCN6 cho tính đa hình cao nhất và thấp nhất là mồi DTN1). Năm mồi còn lại là TN03, TN07, DTN5, OPQ02 và DHN04 không cho tính đa hình (0%).
Giá trị PIC được sử dụng khi phân tích hàm lượng thông tin đa hình, kết quả được thể hiện ở bảng 3.3. Số liệu bảng 3.3 phù hợp với tỉ lệ đa hình của các phân đoạn DNA được nhân bản (bảng 3.2). Cụ thể, giá trị PIC của các mồi TN03, TN07, DTN5, OPQ02 và DHN04 là 0 (không đa hình) và giá trị PIC của mồi OCN6 là 0,57 (đa hình cao nhất). Tuy nhiên, giá trị PIC không chỉ liên quan tới tỉ lệ phân đoạn DNA đa hình mà còn cho biết số lượng cá thể cùng xuất hiện phân đoạn đa hình lớn hay nhỏ (bảng 3.3).
Bảng 3.3: Hàm lượng thông tin tính đa hình (PIC) của 5 mẫu dẻ
STT Tên mồi Giá trị PIC STT Tên mồi Giá trị PIC 1 DTN1 0,32 6 TN03 0,00 2 DTN2 0,34 7 TN07 0,00 3 OPM5 0,38 8 DTN5 0,00 4 APR08 0,36 9 OPQ02 0,00 5 OCN6 0,57 10 DHN04 0,00
Với 10 mồi ngẫu nhiên được sử dụng cho 5 mẫu dẻ khác nhau cho thấy, có 5 mồi thể hiện sự sai khác về các phân đoạn DNA được nhân bản, 5 mồi
còn lại không có sự sai khác về các phân đoạn DNA được nhân bản giữa các đối tượng nghiên cứu. Giá trị PIC dao động từ 0,32 đến 0,57. Như vậy, với 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu đã đưa ra được sự khác nhau về độ tương đồng các phân đoạn DNA của 5 mẫu dẻ phân bố ở các khu vực địa lý khác nhau là Trùng Khánh - Cao Bằng, Yên Thế - Bắc Giang và Vân Nam - Trung Quốc.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR-RAPD trên gel agarose 1,8% của 4 mồi DTN1, DTN2, OPM5 và TN03 được thể hiện dưới đây:
Mồi TN03: Trong phạm vi vùng phân tích, thu được tổng số 30 phân đoạn DNA với kích thước nằm trong khoảng 200bp - 2000bp, (mỗi mẫu dẻ nghiên cứu đều thu được 6 phân đoạn DNA). Các phân đoạn DNA được nhân bản của các mẫu dẻ có kích thước hoàn toàn giống nhau (hình 3.2A). Như vậy, sử dụng mồi TN03 không phát hiện được sự sai khác về các phân đoạn DNA đa hình được nhân bản.
TK1TK2 TK3 BG TQ M TK1 TK2 TK3 BG TQ M
TN03 DTN2
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 5 mẫu dẻ với mồi TN03 và DTN2 ←1000bp ←250bp ←250bp ←1000bp ←500bp ←20000bp ←500bp A B
Mồi DTN2: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR với mồi DTN2 thu được tổng số phân đoạn DNA của 5 mẫu dẻ là 27 phân đoạn. Kích thước các phân đoạn DNA thu được dao động trong khoảng 200bp - 1000bp. Trong đó, xuất hiện 5 phân đoạn DNA khác nhau giữa các mẫu nghiên cứu. Cụ thể, ở kích thước khoảng 600bp, mẫu dẻ BG có phân đoạn DNA được nhân bản các mẫu còn lại không xuất hiện phân đoạn này. Ngược lại, ở kích thước khoảng 200bp và 750bp, bốn mẫu còn lại đều có phân đoạn DNA xuất hiện, trong khi đó mẫu dẻ BG không xuất hiện các phân đoạn DNA có kích thước trên (hình 3.2B).
Mồi DTN1: Trên phạm vi vùng phân tích thu được 22 phân đoạn DNA (thuộc 6 phân đoạn). Kích thước các phân đoạn dao động trong khoảng 250bp - 1500bp. Trong số 6 phân đoạn xuất hiện trên bảng điện di, có 4 phân đoạn hoàn toàn giống nhau giữa các mẫu nghiên cứu nằm trong khoảng kích thước 750bp - 1500bp. Mẫu dẻ Bắc Giang có 2 phân đoạn DNA được nhân bản với kích thước khoảng 250bp và 500bp nhưng các mẫu còn lại không xuất hiện phân đoạn này (hình 3.3A).
TK1 TK2 TK3 BG TQ M TK1 TK2 TK3 BG TQ M
DTN1 OPM05
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 5 mẫu dẻ với mồi DTN1 và OPM5
←250bp ←500bp ←1500bp ←1000bp ←250bp A B
Mồi OPM5: Tổng số có 5 phân đoạn DNA xuất hiện và có hai phân đoạn DNA thể hiện sai khác giữa các mẫu nghiên cứu. Kích thước các phân đoạn được nhân bản dao động từ 200bp - 1000bp. Ở kích thước 200bp và 1000bp, mẫu Bắc Giang tiếp tục xuất hiện phân đoạn DNA được nhân bản. Tuy nhiên, bốn mẫu còn lại không thu được hai phân đoạn này. Ở phạm vi kích thước 500bp - 800bp, cả 5 mẫu đều nhân được 3 phân đoạn DNA như nhau (hình 3.3B).
Như vậy, điện di sản phẩm PCR-RAPD trên gel agarose 1,8% đã khẳng định sự khác biệt về phân đoạn DNA được nhân bản của mẫu dẻ Bắc Giang so với bốn mẫu dẻ ở Trùng Khánh và Trung Quốc.