Đỉnh sinh trƣởng [5]
Mô phân sinh ngọn chứa những tế bào ĐST, được bao bọc bởi một lớp vỏ cutin để hạn chế tối đa sự mất nước. Lớp cutin này bao bọc luôn cả chồi ngọn.
Hình 2.1 Cấu tạo cơ bản của đỉnh sinh trưởng (Nguồn: tài liệu internet [36])
Ở thực vật, sự hình thành mới cơ quan bắt đầu từ trong các mô phân sinh ngọn, các mô này được phân hóa ngay từ những giai đoạn phát triển đầu tiên của phôi do sự
phân hóa của các tế bào sơ khởi. Tất cả các tế bào còn lại đều xuất phát từ tế bào sơ khởi.
Vì mô phân sinh có kích thước tương đối ổn định nên các tế bào sinh ra từ tế bào sơ khởi qua vài lần phân chia sẽ tách rời khỏi mô phân sinh. Quá trình sinh trưởng của đỉnh sinh trưởng được chia thành 3 giai đoạn:
i. Giai đoạn thứ nhất thường được gọi là giai đoạn khởi sinh, trong các điểm sinh trưởng (trong các mô phân sinh ngọn) xảy ra sự hình thành mầm cơ quan và sự phân chia đầu tiên của nó thành các mô riêng biệt.
ii. Giai đoạn thứ hai là giai đoạn kéo dài do sự tăng trưởng nhanh chóng, mầm cơ quan đạt đến kích thước tối đa và trở nên có hình dạng nhất định.
iii. Giai đoạn thứ ba, kết thúc sự phân hóa tế bào, bắt đầu dẫn đến sự hóa gỗ các thành tế bào, và kết quả là mô không còn khả năng sinh trưởng.Trước hết các u lồi dần dần được tạo thành và được gọi là những u lá. Thể tích và chiều dài của u lá tăng rất nhanh kéo theo phần lớn của ĐST. U lồi chuyển dần thành phác thể lá (thể nguyên thủy của lá) và phác thể lá phát triển nhanh về chiều dài. Sau khi lá được tách ra, sự phân chia tế bào sẽ được lặp lại. Kết quả là ĐST được khôi phục nhanh chóng và sự hình thành lá mới lại bắt đầu.
Ở mỗi nách lá đều có chồi nách (chồi bên). Chồi bên thực chất có cấu tạo không khác ĐST thân. Do hiện tượng ưu thế ngọn, chồi bên không phát triển, nhưng khi thoát khỏi sự áp chế của chồi ngọn thì chúng bắt đầu tăng trưởng và có lá đầy đủ như thân chính.
Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng [5,14]
White (1943; trích dẫn bởi [5]) cho rằng virus khảm thuốc lá (TMV) có mặt trong các phần khác nhau trên rễ cây thuốc lá, mật độ virus giảm dần khi đến chóp rễ, và ngay ở chóp rễ hoàn toàn không có virus. Limasset và Cornuet (1949; trích dẫn bởi [5]) cho rằng có một khuynh độ về mật độ virus trong chồi ngọn cây thuốc lá và ở mô phân sinh thì hoàn toàn sạch virus. Các nghiên cứu cho rằng ĐST ngọn và chóp rễ không mang virus. Tuy nhiên ở một số loài thực vật virus cũng hiện diện trong ĐST của cây (Pierik, 1987) . Theo Quak (1966; trích dẫn bởi [15]) ở ĐST có sự canh tranh giữa sự sinh sản của virus và sự phân chia của tế bào mô phân sinh (Pierik, 1987). Trong quá trình phân chia của tế bào, quá trình sinh tổng hợp acid nucleic được tăng
cường do đó gây bất lợi cho sự tăng sinh của virus. Lúc này các tế bào phía dưới ĐST chủ yếu gia tăng kích thước do đó virus có thể sản sinh được. Quak (1966) còn cho rằng trong ĐST không có sự hiện diện của bó mạch và cầu liên bào nên gây trở ngại cho sự chuyển động của virus. Có nhiều giả thuyết về yếu tố gây trở ngại cho sự xâm nhập của virus vào ĐST như nồng độ auxin và cytokinin, enzym cần thiết cho sự tăng sinh của virus…nhưng các giả thuyết trên chưa được chứng minh.
Morel và Martin (1952; trích dẫn bởi [15]) đã đưa ra sáng kiến cô lập ĐST cây thược dược bị nhiễm virus đưa vào nuôi cấy in vitro và thu được cây sạch bệnh. Họ cũng là những người đầu tiên tạo được cây thược dược và khoai tây sạch bệnh bằng cách nuôi cấy ĐST. Sau đó, phương pháp này được áp dụng với những cây trồng quan trọng như khoai tây, Trifolium, mía … và những cây thân gỗ.
Khi nuôi cấy ĐST nên chọn những cây đang tăng trưởng để thu ĐST. Nếu ĐST cô lập đang ở trong trạng thái hoạt động (gồm vùng mô phân sinh và cả phần dưới ngọn) thì cơ hội loại trừ virus sẽ lớn hơn.
Nên tách lấy vòm mô phân sinh (meristematic dome) và 1 cặp lá đầu tiên. Nếu lấy đoạn lớn hơn sẽ tạo điều kiện truyền virus. Kích thước của mô phân sinh và lá từ 0,1 – 0,5 mm [36]. Vòm đỉnh (apical dome) có kích thước từ 0,1 – 0,25 mm phụ thuộc vào loài và sự cân bằng về kích thước. ĐST phải đủ nhỏ để đảm bảo sạch virus và các tác nhân gây bệnh khác đồng thời đủ lớn để có thể phát triển thành chồi. Mặc dù rễ có thể hình thành trực tiếp từ chồi trong cùng môi trường, nhưng thường chồi phải được chuyển sang môi trường tạo rễ để phát triển.
Tỉ lệ cây sạch virus thu được phụ thuộc vào nhiều yếu tố như vật liệu khởi đầu như ĐST của chồi ngọn hay chồi bên (Styer và Chin, 1983; trích dẫn bởi [5]), thời gian thu mẫu trong năm (Van Os, 1964; trích dẫn bởi [5]), thành phần môi trường, nhiệt độ nuôi cấy, nhiệt độ xử lí…
Tỉ lệ cây sạch bệnh thu được bằng phương pháp nuôi cấy ĐST thường rất nhỏ. Nguyên nhân là do mẫu bị nhiễm, bị hư hại, bị khô nước và bị hóa nâu, môi trường nuôi cấy không phù hợp; có khi ĐST không tăng trưởng do đang ở trong trạng thái hưu miên. Trong trường hợp thu được cây hoàn chỉnh từ nuôi cấy ĐST thì cần kiểm tra xem cây có thực sự sạch virus không. Nếu cây sạch virus thì sẽ được sử dụng làm cây mẹ để nhân giống vô tính, tạo ra nhiều cây sạch virus.
Hình 2.2 Qui trình nuôi cấy ĐST. (A) phần mô phân sinh đỉnh được cắt. (B) ĐST được cấy trên môi trường agar. (C) cây con tái sinh từ ĐST. (D) cây con được chuyển ra đất đã khử trùng
(Nguồn: theo tài liệu internet [39])
2.8.3.3 Xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST
Để làm tăng cơ hội thu được cây sạch bệnh trong những trường hợp khó khăn (cây bị nhiễm bởi nhiều loại virus) thì nên xử lí nhiệt trước khi thu ĐST để nuôi cấy nhằm làm giảm số lượng virus hoặc làm tăng diện tích vùng không bị nhiễm virus. Thời gian xử lí nhiệt thay đổi từ 5 – 10 tuần với nhiệt độ 35 – 380C (Quak, 1977; trích dẫn bởi [15]). Phương pháp trên đã được sử dụng thành công với khoai tây, cúc, cẩm chướng và dâu tây. Theo Morel (1964; trích dẫn bởi [5]), khi giữ củ khoai tây ở nhiệt độ 37 – 380C trong một tháng trước khi tiến hành nuôi cấy ĐST thì sẽ thu được cây sạch bệnh.
Xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST có thể loại bỏ virus, vi khuẩn, và nấm nhưng không loại bỏ được viroid. Khác với virus, viroid là RNA không có vỏ protein – chúng là RNA trần và rất khó loại bỏ. Thường những cây bị nhiễm phải bị hủy [36].
Sơđồ 2.3 Qui trình tạo cây sạch bệnh bằng phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST.
(Nguồn: theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)