I: quy trình ly trích 2 S: quy trình ly trích
PHỤ LỤC D CÁC BƢỚC VẬN HÀNH MÁY iCycler iQ
Máy iCycler iQ cho phép quan sát trực tiếp trên máy tính điều khiển diễn biến của phản ứng Real - time PCR theo các chu kỳ nhiệt.
1. Mở máy iCycler iQ theo thứ tự lần lượt: buồng nhiệt, đầu đọc iQ, máy vi tính điều khiển. Sau khi máy khởi động xong, vào start chọn all program, chọn iCycler, chọn instrument mode để kích hoạt điều khiển máy iCycler iQ.
2. Trên màn hình desktop, click vào hiển thị iCycler, màn hình vi tính hiển thị hình máy Bio – Rad và nhấn Yes để máy vi tính kích hoạt điều khiển Real - time PCR. Lúc này màn hình máy iCycler iQ hiển thị dịng chữ host control mode. Khi đĩ buồng PCR được nhận diện và được điều khiển qua máy vi tính.
3. Mở buồng máy cho ống chứa hỗn hợp phản ứng Real - time PCR vào máy (chú ý lau sạch ống bằng fisher lens paper cả phía đáy lẫn nắp ống. Đĩng buồng PCR lại.
4. Thao tác trên máy vi tính điều khiển
Bước 1: vào view protocol để chọn chương trình đã cài sẵn hay thiết lập chương trình mới trên máy tính điều khiển, chọn theo các hướng dẫn sau:
- Create a new protocol: cài đặt một chương trình mới. Vào save protocol để lưu lại chương trình vừa cài vào máy điều khiển.
- Edit this protocol: hiệu chỉnh một chương trình đã cĩ. Edit protocol đặt tên chương trình, cài đặt các chu trình nhiệt của phản ứng Real - time PCR theo hướng dẫn trên màn hình vi tính. Sau đĩ vào save protocol để lưu.
Bước 2: vào view plate setup để chọn các vị trí đặt ống phản ứng đã cài sẵn hay thực hiện cài đặt các vị trí mới trên máy tính điều khiển theo hướng dẫn như sau:
- Edit plate setup
Dùng mũi tên nhấn vào erase rồi di chuyển mũi tên đến ơ vuơng ở gĩc trên trái để xĩa các vị trí cĩ sẵn, chọn vị trí đặt ống PCR trên plate của máy iCyler iQ. Dùng mũi tên chọn tên của các vị trí như: unknown, standard, control (-), control (+) và click vào các vị trí muốn chọn. Muốn ghi tên của mẫu trên vị trí đã chọn vào Identifier.
- Sau khi chọn vị trí xong, vào select and fluorophore để chọn màu và kính lọc: chọn FAM, SYBR,…Sau đĩ chọn màu hiển thị, dùng mũi tên nhấp vào gĩc trên trái của màn hình biểu diễn plate để chọn màu cho các giếng. Tiến hành lưu plate đã cài đặt.
Bước 3: vào run with selected plate setup hay run with selected protocol để chạy Real - time PCR. Khơng thay đổi các thơng số và hiển thị cài đặt sẵn. Click begin run, màn hình máy tính sẽ hiển thị lệnh lưu tên, dữ liệu sẽ cĩ vào user 1. Đặt tên cho tập tin dữ liệu sẽ cĩ và chọn save. Máy bắt đầu chạy với hiển thị màn hình run time central với hoạt động performing bias optimizing rồi sẽ vào hiển thị nhiệt độ, đến lúc này ta sẽ biết máy hoạt động bình thường.
Bước 4: sau khi máy chạy xong, ta cĩ thể phân tích kết quả ngay hay vào view post run data để phân tích kết quả các dữ liệu của mẫu đã chạy Real - time PCR. Thực hiện theo đường dẫn:
- Chọn view post run data\tên tập tin cần phân tích\analyze data. Lúc này màn hình hiển thị các thơng tin về dữ liệu cần phân tích.
- Chọn PCR quantification xem phân tích Ct. Chọn standard curve để xem đường chuẩn, hiệu quả phản ứng Real - time PCR, hệ số tương quan r2.
- Chọn melt curve để phân tích nhiệt độ nĩng chảy của sản phẩm Real - time PCR tạo thành để xác định mẫu dương hay âm tính đối với thí nghiệm dùng chất chỉ thị huỳnh quang là SYBR Green I.
Bước 5: vào report để xuất kết quả: lựa chọn dữ liệu cần xuất. File xuất ra cĩ thể lưu dưới một tập tin khác trong file word.