Hiện nay người ta sử dụng một trong ba nhĩm phương pháp sau để xác định khả năng xúc tác của enzyme:
23 • Tiến hành đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành sau một
thời gian nhất định và lượng enzyme đã xác định trước.
• Tiến hành xác định thời gian cần thiết để thu nhận được một lượng biến đổi nhất định của lượng cơ chất hay lượng sản phẩm tương ứng với một lượng enzyme nhất định. • Tiến hành chọn nồng độ enzyme cần thiết để trong một thời gian nhất định sẽ thu
được sự biến đổi nhất định về cơ chất hay sản phẩm. 2.5.3.2. Đơn vị hoạt độ
Khả năng xúc tác của enzyme được xác định thơng qua hoạt độ hoạt động của enzyme. Hoạt độ hoạt động của enzyme được xác định thơng qua đơn vị hoạt độ. Người ta biểu diễn đơn vị hoạt độ qua những đơn vị:
• Đơn vị hoạt độ quốc tế (UI) • Đơn vị Katal (Kat)
• Đơn vị hoạt độ riêng
• Đơn vị hoạt độ riêng phân tử
• Ngồi ra cịn cĩ nhiều cách biểu thịđơn vị hoạt độ của enzyme như: đơn vị
Wohgemuth cải tiến (MWU), đơn vị SKB, GAU, NU, HU, AU... Các đơn vị hoạt độ này được trình bày chi tiết ở mục 3.7 phần phụ lục.
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN
Khĩa luận được thực hiện từ ngày 15/2/2005 đến 15/6/2005 tại phịng thí nghiệm Vi Sinh khoa Cơng Nghệ Sinh Học trường Đại học Mở Bán Cơng thành phố Hồ Chí Minh.
3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.2.1. Giống vi khuẩn
Chế phẩm chúng tơi sản xuất sử dụng hai loại vi khuẩn:
• Bacillus subtilis ATCC - 6633 được cung cấp từ khoa Cơng Nghệ Sinh Học trường Đại học Mở Bán Cơng thành phố Hồ Chí Minh.
• Lactobacillus acidophilus được phân lập từ chế phẩm Antibio do Hàn Quốc sản xuất.
3.2.2.Thiết bị - dụng cụ
• Thiết bị: Tủ ấm, tủ sấy, giá đỡ ống nghiệm, nồi hấp autoclave, tủ lạnh, giấy
đo pH, kính hiển vi, cân, máy lắc, đường kế, bếp điện…
• Dụng cụ: ống nghiệm, que cấy, đĩa petri, pipet, micropipet, đầu type vơ trùng, que cấy trang, đũa thủy tinh, khăn giấy…
3.2.3. Hĩa chất
• Các loại thuốc nhuộm: crystal violet, fushin, lugol…
• Thuốc thử kowac, methyl red, NaOH 1N, HCl 1N, H2O2 30%, dầu soi kính, cồn... • Dung dịch tinh bột 0,1%, dung dịch NaCl 0,1%, dung dịch iốt 0,02%, dung
dịch casein 0,1%...
3.2.4. Mơi trường nuơi cấy
3.2.4.1. Đối với Bacillus subtilis
• Mơi trường tăng sinh nutrien broth (NB)
• Mơi trường giữ giống và đếm số lượng tế bào nutrien agar (NA)
• Mơi trường nhân giống cấp1: mơi trường Frage, mơi trường pepton – gelatin, mơi trường chứa mật rỉ đường + 2 % tinh bột, mơi trường Edward và mơi trường Nomura.
• Mơi trường sản xuất: bắp, đậu nành, bột sữa, bột mì… (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
25 3.2.4.2. Đối với Lactobacillus acidophilus
• Mơi trường tăng sinh chọn lọc MRSB • Mơi trường phân lập MRSA
• Mơi trường nuơi cấy và thử các phản ứng sinh hĩa
• Mơi trường sản xuất: mơi trường sữa đặc cĩ đường và mơi trường sữa đậu nành. Thành phần và tỉ lệ các loại mơi trường được trình bày chi tiết ở mục 1 phần phụ lục.
3.3. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.3.1. Đối với Bacillus subtilis 3.3.1. Đối với Bacillus subtilis
3.3.1.1. Khảo sát khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtilis trên mơi trường nhân giống cấp 1 trường nhân giống cấp 1
Cách tiến hành:
Giống gốc chứa Baclillus subtilis được tăng sinh trong mơi trường NB cĩ pH = 7 trong thời gian 24 giờ ở nhiệt độ 37oC. Sau 24 giờ cho dung dịch tăng sinh này vào từng loại mơi trường: Edward, Nomura, Fragie, Rỉ đường + tinh bột 2%, và pepton- gelatin với các điều kiện khảo sát:
• Nhiệt độ: nhiệt độ phịng • Lượng giống: 5%
• pH = 7
• Thời gian nuơi cấy là 48 giờ
• Nhu cầu oxi: sử dụng máy lắc
Sau 48 giờ nuơi tiến hành kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn, hoạt độ enzyme amylase và protease.
Phương pháp đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đếm trực tiếp trên lame (được trình bày ở mục 3.6 phần phụ lục)
Phương pháp kiểm tra hoạt độ enzyme:
o Kiểm tra hoạt độ enzyme amylase bằng phương pháp Wolhgemuth (xem mục 3.1 phần phụ lục)
o Kiểm tra hoạt độ enzyme protease bằng phương pháp Gross + Fuld (Xem mục 3.2 phần phụ lục)
Sau khi kiểm tra số lượng và hoạt độ enzyme trên từng loại mơi trường chúng tơi chọn
được mơi trường nhân giống cấp 1 tối ưu nhất để tiếp tục nhân giống trên mơi trường nhân giống cấp 2. Thí nghiệm được lập lại 3 lần.
Số lượng tế bào vi khuẩn Hoạt độ enzyme amylase Hoạt độ enzyme protease Mơi trường Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần3 Edward Fragie Nomura Pepton - gelatin Rỉđường + tinh bột 2%
27 Giống gốc Bacillus subtilis Mơi trường NB (nutrien broth) Tăng sinh Mơi trường Nomura Mơi trường Fragie
Mơi trường rỉ đường +2 % tinh bột Mơi trường Edwards Mơi trường pepton - gelatin 5 % giống 48 giờ, to phịng Kiểm tra Hoạt tính enzyme amylase Số lượng vi khuẩn cĩ trong 1ml Hoạt tính enzyme protease Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis Bảo quản, kiểm tra Chọn mơi trường tối ưu nhất Mơi trường A Mơi trường B Mơi trường D Mơi trường C 10 % giống Chọn mơi trường tối ưu nhất Mơi trường E
3.3.1.2. Khảo sát khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtilis trên mơi trường nhân giống cấp 2 trường nhân giống cấp 2
Sau khi chọn lọc được mơi trường nhân giống cấp 1 tốt nhất chúng tơi tiến hành xác định mơi trường nhân giống cấp 2 tối ưu nhất. Cách bố trí thí nghiệm được thực hiện như sau:
Mơi trường sử dụng là mơi trường bán rắn gồm 5 loại mơi trường A, B, C, D và E cĩ bổ sung CaCO3 2% để ổn định pH mơi trường. Tất cả các loại mơi trường trước khi
đem nuơi cấy đều được hấp khử trùng ở 121oC trong 15 - 20 phút. Các thành phần mơi trường này được trình bày chi tiết ở mục 1.11 phần phụ lục.
Lượng giống sử dụng ở mơi trường nhân giống cấp 2 là 10%, với độẩm 60 – 65%, pH = 7. Từng loại mơi trường được đặt trong các khay bằng nhựa cĩ kích cỡ 0,5 × 0,25 × 0,08 m, mỗi khay chứa 0,6 kg mơi trường. Trong quá trình nuơi phải giữ ẩm cho mơi trường bằng cách phủ vải ẩm. Sau thời gian 72 giờ nuơi bắt đầu thu hoạch sau đĩ đem sản phẩm này kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn và hoạt độ enzyme amylase, protease.
Sau khi kiểm tra trên tất cả các mơi trường A, B, C, D và E chúng tơi tìm được mơi trường nhân giống cấp 2 cho sinh khối và hoạt độ enzyme cao nhất để tiến hành sản xuất. Mỗi mơi trường thí nghiệm được lập lại 3 lần.
Số lượng tế bào vi khuẩn Hoạt độ enzyme amylase Hoạt độ enzyme protease Mơi trường Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần3 A B C D E
29 3.3.1.3. Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi tìm được mơi trường nhân giống cấp 2 tối ưu nhất chúng tơi tiến hành sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis. Cách thực hiện tương tự như thí nghiệm 3.3.1.2. Sau thời gian nuơi 72 giờ bắt đầu thu hoạch và đem sấy ở nhiệt độ 40 - 45oC trong 2 ngày sao cho sản phẩm khơ hồn tồn. Sau đĩ đem đĩng gĩi, kiểm tra và bảo quản. Quy trình sản xuất
được thực hiện theo sơđồ 3.2. Nước 60 – 65 % so với nguyên liệu
Mơi trường nhân giống cấp 2 tối ưu Khống hỗn hợp Hấp khử trùng 1210C trong 20 - 25 phút Đổ lên khay Làm nguội đến 37oC Nuơi 72 giờở nhiệt độ phịng Giống Bacillus subtilis 10% Sấy khơ 40 - 45oC Đánh tơi Xay mịn Đĩng gĩi, kiểm tra và bảo quản
Sơđồ 3.2. Sơđồ quy trình sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis
Chế phẩm chứa Bacillus subtilis
3.3.1.4. Kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn và hoạt độ enzyme
Chế phẩm chứa Bacillus subtilis sau khi sấy khơ tiến hành kiểm tra số lượng và hoạt độ
enzyme amylase, protease và sau thời gian bảo quản 10, 20, 30 ngày ở nhiệt độ phịng. Phương pháp kiểm tra tương tự như thí nghiệm 3.3.1.1.
31 3.3.2. Đối với Lactobacillus acidophilus Phân lập Chế phẩm Antibio (chứaL. acidophilus) MRSA MRSB tăng sinh (24 giờ /37oC)
Mơi trường sữa đặc cĩ đường Mơi trường sữa đậu nành
24 giờ, nhiệt độ phịng Kiểm tra
Số lượng vi khuẩn cĩ trong 1ml Độ chua Therne Chọn khuẩn lạc điển hình
Kiểm tra sinh hĩa
Xác định Lactobacillus acidophilus
Sơđồ 3.3. Sơđồ bố trí thí nghiệm đối với Lactobacillus acidophilus
Kiểm tra, đĩng gĩi và bảo quản
Sản xuất chế phẩm chứa L. acidophilus
trên mơi trường tối ưu Chọn ra mơi trường
3.3.2.1. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 3.3.2.1. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 3.3.2.1. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus acidophilus
Mẫu phân lập
Mẫu phân lập: sử dụng chế phẩm Antibio chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus do Hàn Quốc sản xuất. 10-4 10-5 10-6 10-7 Đồng nhất và pha lỗng mẫu Quy trình phân lập: 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1 gam mẫu + 9ml dd NaCl 90/00 10-2 10-3 10-1
Mơi trường phân lập MRSA Chọn khuẩn lạc điển hình, nhuộm Gram và thử các phản ứng sinh hĩa Mơi trường giữ giống MRSA Cấy giữ giống Cách tiến hành
Sơđồ 3.4. Quy trình phân lập vi khuẩn Lactobacillus acidophilus
Cho 1 gam chế phẩm Antibio hịa vào 9 ml nước muối sinh lý (nồng độ 9 o/oo) sau đĩ lắc đều sao cho dung dịch trở nên đồng nhất ta được dung dịch cĩ nồng độ pha lỗng 10-1. Tiếp theo lấy 1ml dung dịch 10-1 cho vào 9 ml dung dịch NaCl 9 o/oo ta được dung dịch cĩ nồng độ 10-2. Tiếp tục như thế cho đến khi được các dung dịch cĩ nồng độ 10-6, 10-7. Dùng micropipet hút 0,2 ml dịch khuẩn ở nồng độ 10-6, 10-7 (mỗi nồng độ cho vào 2
đĩa) trang đều trên mặt thạch chứa mơi trường MRSA sau đĩ đem ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ và chọn khuẩn lạc nghi ngờ (khuẩn lạc trịn đều, nhơ lên và bên ngồi cĩ
33 vịng trong) đem nhuộm Gram và cấy giữ giống. Những khuẩn lạc nghi ngờ này được tăng sinh trong mơi trường MRSB trong 24 giờ ở nhiệt độ 37oC để tiến hành thử các phản ứng sinh hĩa.
Xác định vi khuẩn Lactobacillus acidophilus
Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus xác định dựa trên các phương pháp truyền thống như:
o Quan sát hình dạng tế bào khuẩn lạc và sự bắt màu khi nhuộm Gram. o Thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hĩa.
Phản ứng Kết quả Lên men đường Kết quả Indol VP MR Citrat Nitrat Di động Catalase Khả năng đơng vĩn sữa Lactose Sucrose Glucose Manitol Rabinose (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.3.2.2. Khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn và độ chua Therne trên mơi trường sữa
đặc cĩ đường
Giống L. acidophilus sau khi phân lập được tăng sinh trên mơi trường MRSB trong thời gian 24 giờ ở 37oC. Sau đĩ cho lượng giống 5 % vừa tăng sinh này vào mơi trường sữa đặc cĩ đường với từng nồng độ là:15%, 20% và 25% sữa. Sau thời gian nuơi 24 giờ
với pH = 6,5 - 7 ở nhiệt độ phịng chúng tơi tiến hành kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn và độ chua Therne của từng loại mơi trường.
Độ chua Therne (g) Số lượng tế bào vi khuẩn Nồng
độ sữa (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 15
20 25
3.3.2.3. Khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn và độ chua Therne trên mơi trường sữa
đậu nành
Tương tự như ở thí nghiệm 3.3.2.2 sử dụng 5% giống cho vào mơi trường sữa đậu nành với nồng độ đậu nành là 10%, 15% và 20%. Ứng với mỗi nồng độđậu chúng tơi khảo sát từng nồng độ đường cho vào là 0%, 10%, 15% và 20%. Những nồng độ này
được ký hiệu như sau:
o Ở nồng độ 10% đậu cĩ bổ sung từng hàm lượng đường là 0%,10%,15% và 20% được ký hiệu lần lượt là NA0, NA10, NA15, NA20.
o Tương tựở nồng độ 15% đậu cĩ: NB0, NB10, NB15 và NB20. o Ở nồng độ 20% đậu cĩ: NC0, NC10, NC15 và NC20.
Sau thời gian nuơi cấy là 24 giờ, pH = 6,5 - 7 ở nhiệt độ phịng chúng tơi tiến hành kiểm tra độ chua Therne và số lượng tế bào vi khuẩn tương tự như thí nghiệm 3.3.2.2.
Độ chua Therne Số lượng tế bào vi khuẩn Nồng độ đậu nành hiKí ệu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 NA0 NA10 NA15 10% NA20 NB0 NB10 NB15 15% NB20 NC0 NC10 NC15 20% NC20 3.3.2.4. Tiến hành sản xuất thử chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus
Từ kết quả khảo sát độ chua và số lượng tế bào vi khuẩn ở hai loại mơi trường sữa
đặc cĩ đường và sữa đậu nành chúng tơi chọn được mơi trường tối ưu nhất để tiến hành sản xuất thử chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus.
Sau 24 giờ nuơi trên mơi trường tối ưu ở nhiệt độ phịng với lượng giống cho vào là 5%. Chúng tơi bắt đầu thu hoạch và đem phối trộn với bột đậu nành khơ đã qua khử
35 trùng (sấy 100oC trong 2giờ). Tỷ lệ phối trộn là 1:1 sau đĩ đem sấy ở nhiệt độ 40 - 45oC trong 2 ngày sao cho sản phẩm khơ hồn tồn. Sản phẩm này được xây mịn, đĩng gĩi sau đĩ đem kiểm tra và bảo quản ở nhiệt độ phịng.
3.3.2.5. Kiểm tra sản phẩm sau thời gian bảo quản
Sản phẩm sau khi sấy khơ chúng tơi tiến hành kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn cĩ trong 1 gam sản phẩm và sau thời gian bảo quản 10 và 20 ngày bằng phương pháp
đếm số lượng tế bào sống trên thạch (được trình bày chi tiết ở mục 3.5 phần phụ lục).
3.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 3.4.1. Xử lý số liệu 3.4.1. Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab release 13.20 để so sánh sự
khác biệt giữa các mơi trường.
Đối với thí nghiệm trên Bacillus subtilis
Mơi trường nhân giống cấp 1 và mơi trường nhân giống cấp 2 chúng tơi dùng dùng trắc nghiệm 1 yếu tốđể xem tác động của:
Mơi trường lên số lượng tế bào vi khuẩn
Mơi trường lên hoạt độ enzyme amylase
Mơi trường lên hoạt độ enzyme protease (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đối với thí nghiệm trên Lactobacillus acidophilus
Mơi trường sữa đặc cĩ đường dùng trắc nghiệm một yếu tốđể xem ảnh hưởng của nồng độ sữa lên số lượng và độ chua của L. acidophilus.
Mơi trường sữa đậu nành dùng trắc nghiệm hai yếu tố là nồng độ đậu nành và hàm lượng đường trong sữa đậu nành để:
So sánh sự khác biệt giữa từng nồng độđậu và từng hàm lượng đường lên số lượng và độ chua Therne của sữa.
Ảnh hưởng của nồng độđậu và hàm lượng đường lên số lượng và độ chua của sữa.
3.4.2. Biểu đồ
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. ĐỐI VỚI BACILLUS SUBTILIS
4.1.1. Kết quả về khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtilis trên mơi trường nhân giống cấp 1 mơi trường nhân giống cấp 1
Sau khi nuơi cấy trên 5 loại mơi trường Edward, Fragie, pepton-gelatin, Nomura và rỉ đường cĩ bổ sung 2% tinh bột trong thời gian 48 giờ ở nhiệt độ phịng, pH = 7 chúng tơi tiến hành theo dõi các chỉ tiêu về số lượng, khả năng sinh enzyme amylase, protease với kết quả như sau.
4.1.1.1. Khả năng tăng sinh khối
Bảng 4.1. Số lượng tế bào Bacillus subtilis trên từng loại mơi trường nhân giống cấp 1
Ghi chú : Chữ a, b, c, d chỉ sự khác biệt về mặt thống kê giữa từng loại mơi trường
Qua bảng 4.1 chúng tơi nhận thấy số lượng tế bào trung bình ở mơi trường rỉ đường cĩ bổ sung 2% tinh bột là cao nhất ở mức 1,92 ×1010 cfu/ml. Kết quả xử lý thống kê cho thấy cĩ sự khác biệt giữa các loại mơi trường là cĩ ý nghĩa (P < 0,01).
4.1.1.2. Khả năng sinh enzyme amylase và protease