3. Nội dung nghiên cứu
3.1.2. Nhân vùng điều khiển D-Loop của DNA ty thể
Tốc độ tích lũy đột biến trong vùng trình tự điều khiển cao gấp 5-10 lần so với các gen khác trong hệ gen ty thể, do đó nó rất có ý nghĩa rất quan trọng trong nghiên cứu đa dạng sinh học và sự phát sinh chủng loại của sinh vật. Nhằm mục đích đánh giá tính đa dạng di truyền của 3 giống gà Ri, Mông và Đa cựa, chúng tôi đã sử dụng vùng trình tự D-Loop trong hệ gen ty thể làm
đối tƣợng nghiên cứu.
Để nhân vùng D-Loop từ mẫu DNA tổng số đã thu đƣợc chúng tôi tiến hành PCR với việc sử dụng cặp mồi H1255 và L16725.
L16725 (Tm = 60oC): 5'-AGGACTACGGCTTGAAAGC-3 '(19 nucleotit)
H1255 (Tm = 55OC): 5'-CATCTTGGCATCTTCAGTGCC-3 '(21nucleotit)
Cặp mồi này đƣợc thiết kế dựa trên trình tự hai đầu đoạn D-Loop ở gà nhà và là cặp mồi bảo thủ, do đó có thể sử dụng cho nhiều đối tƣợ ng khác trong bộ gà. Theo lý thuyết, sản phẩm thu đƣợc khi nhân bản bằng cặp mồi trên có chiều dài khoảng 1,3 kb.
PCR là loại phản ứng đòi hỏi sự chính xác về chu trình nhiệt của phản ứng cũng nhƣ thành phần và nồng độ các chất tham gia.
• Chu trình nhiệt của PCR
- Giai đoạn biến tính (Denaturation): Nhiệt độ biến tính thƣờng khoảng
94 - 95oC để đảm bảo sau khoảng 30 chu kỳ PCR, Taq vẫn giữ đƣợc hoạt
tính. Thời gian biến tính tùy thuộc vào hàm lƣợng G - C và chiều dài của
phân tử DNA. Chúng tôi chọn nhiệt độ biến tính là 94oC trong 1 phút. Trƣớc
khi bƣớc vào chu kỳ thứ nhất, nhiệt độ đƣợc đặt 94oC trong 4 phút để đảm
bảo phân tử DNA đƣợc biến tính hoàn toàn.
- Giai đoạn gắn mồi (Annealing): Vì Tm nhỏ nhất của cặp mồi trên là
55oC nên nhiệt độ gắn mồi có thể từ 50 - 52oC. Chúng tôi đã thử chạy phản
ứng ở một số giá trị khác nhau trong khoảng nhiệt độ này và chọn đƣợc nhiệt
độ gắn mồi tối ƣu trong thí nghiệm này là 50oC.
- Giai đoạn kéo dài chuỗi (Extension): Nhiệt độ lúc này đƣợc tăng đến
72oC để cho enzym Taq polymerase hoạt dộng tốt nhất. Tốc độ tổng hợp của
phản ứng vào khoảng 1000 nucleotit/phút. Trình tự vùng D-Loop quan tâm có kích thƣớc khoảng 1,3 kb nên thời gian giai đoạn kéo dài chuỗi đƣợc lựa chọn là 1 phút 20 giây.
Sau khi kết thúc 30 chu kỳ, chúng tôi đặt nhiệt độ lên 72oC trong 10 phút để đảm bảo sự tổng hợp đƣợc kết thúc hoàn toàn. Sau đó sản phẩm PCR
đƣợc giữ ở nhiệt độ 4oC.
• Thành phần và nồng độ các chất tham gia:
Tham gia vào phản ứng này là 7 thành phần thiết yếu, đó là: Taq DNA
polymerse, dung dịch đệm, mồi, MgCl2, các dNTP, DNA khuôn và nƣớc.
Trong đó có 3 thành phần thƣờng thay đổi trong từng phản ứng đó là: Mồi,
MgCl2 và DNA khuôn.
- Dung dịch đệm: PCR đƣợc thực hiện trong một môi trƣờng đệm phù hợp với hoạt động của enzym với giá trị pH là 7,2. Trong thí nghiệm này, sau
+
khi khảo sát, chúng tôi sử dụng loại đệm có chứa NH4 của hãng Fementas, nó
phù hợp với hoạt động của enzym Taq polymerase và khoảng biến thiên rộng
về nồng độ của MgCl2. Hơn nữa, loại đệm này cho chất lƣợng sản phẩm tốt
+ hơn so với loại đệm không có chứaNH4 .
- Mồi: Đây là một yếu tố rất quan trọng trong PCR bởi việc điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi và nồng độ của mồi có ảnh hƣởng đến lƣợng sản phẩm thu đƣợc. Nồng độ mồi xuôi và ngƣợc đƣợc sử dụng trong thí nghiệm này là 10pmol/µl.
- MgCl2: Vai trò của ion Mg2+ là tạo phức với dNTP và gắn chúng với
enzym, kích hoạt và tăng sự kết hợp giữa mồi và khuôn. Nồng độ Mg2+ quá
thấp sẽ làm giảm hoạt tính của enzym. Tuy nhiên, nếu nồng độ này quá cao sẽ
ức chế hoạt động của enzym. Sau khi khảo sát, chúng tôi thấy nồng độ Mg2+
là 10mM cho kết quả tốt nhất.
- 4 loại dNTP: Nồng độ của mỗi loại dNTP đều phải bằng nhau và phụ
thuộc nhiều vào kích thƣớc của đoạn DNA đích, nồng độ của mồi và MgCl2.
Nồng độ của các dNTP lớn hơn 4mM sẽ ức chế phản ứng PCR do ion Mg2+ bị
cô lập, dễ dẫn đến sự nhân lên của các đoạn không cần thiết. Qua thử nghiệm, chúng tôi thấy nồng độ của các dNTP 1mM là phù hợp.
- Thành phần cuối cùng của PCR là DNA khuôn có chứa trình tự đích cần nhân lên, nó phải đảm bảo yêu cầu đƣợc tinh sạch và ít bị đứt gãy. Thông thƣờng, hàm lƣợng DNA khuôn trong mỗi hỗn hợp phản ứng là 10 - 100ng/ phản ứng.
Sản phẩm PCR đƣợc bảo quản ở 4oC. Sau khi đƣợc kiểm tra trên gel
agarose 0,8%.
Kết quả thu đƣợc thể hiện trên hình 3.2.
M 1 2 3
Kb
1,5 1,3
1,0
Hình 3.2. Ảnh chụp kết quả điện di sản phẩm PCR
M: Marker; 1: Mẫu gà RI; 2: Mẫu gà Mông; 3: Mẫu gà Đa Cựa
Quan sát ảnh chụp kết quả điện di, cả 3 mẫu đều xuất hiện băng DNA nằm ở vị trí giữa vạch 1,5 kb và 1 kb trên thang kích thƣớc chuẩn (marker), cho thấy kích thƣớc phân tử của sản phẩm PCR vào khoảng 1,3 kb, tức là phù hợp với tính toán theo lý thuyết. Các băng sáng đậm, rõ nét, tập trung và chỉ nhìn thấy băng phụ rất mờ bên dƣới chứng tỏ sản phẩm PCR tƣơng đối đặc hiệu. Kết quả này cho thấy chúng tôi đã nhân đƣợc vùng D-loop. Sản phẩm PCR đặc hiệu chứng tỏ chƣơng trình đã lựa chọn và nồng độ các chất tham gia phản ứng là phù hợp.