Cerebrozit hay glycosphingolipit (GSL), sphingosin, ceramit là nhóm hợp chất thiên nhiên lần đầu tiên phân lập được từ dịch chiết mô não và được mô tả vào nửa sau của thế kỷ 20. Đó là các amit hợp bởi một axít béo với aminoancol đều có
mạch cácbon dài với kích thước khác nhau, có mức độ no hóa và hydroxyl hóa cũng khác nhau, chúng có cấu trúc tổng quát như sau.
R2NH NH R1 HO OH O 1 2 3 1' 2'
Trong cơ thể người có tới 40% lượng ceramit tập trung ở da với chức năng chủ yếu là hình thành rào cản ngăn nước thoát ra khỏi cơ thể. Những chất này cũng tham gia vào hệ miễn dịch của cơ thể với vai trò như là những kháng thể liên kết những tế bào khối u cũng như trong miễn dịch trị liệu ở những dạng ung thư cá biệt. Người ta cũng đã biết các cerebrozit có hoạt tính chống lở loét (anti-ulcerogenic), bảo vệ gan (hepatoprotective), ức chế enzym và kháng khuẩn cao. Gần đây đã phát hiện thấy các cerebrozit trong nấm, trong cây Aralia elata, loài bán hạ Trung Quốc (Typhonium giganteum), loài bán hạ Việt Nam (Typhonium blumei), Penilla ternata, Kỷ tử (Lycium chinense), tỏi (Allium sativum), đậu nành (Glycine max), trong động vật không xương sống như đỉa, cua biển, vi sinh vật biển, trong sao biển, bọt biển, hải sâm, san hô mềm (Xem phần tổng quan, Mục 1.2.4.2.).
Từ dịch chiết etylaxetat củ, rễ của cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) đã thu được một hợp chất rắn kết tinh dạng vô định hình (0,021g/800g=0,003%), màu xám, có điểm nóng chảy 189-190 0
C, không tan trong nước, tan ít trong metanol, nhưng tan rất tốt trong hệ dung môi CHCl3/MeOH (tỷ lệ 2:1 v/v).
Trong phổ FT-IR (KBr), quan sát thấy các hấp thụ đặc trưng ở tần số 3380,35; và 3365 cm-1 là dao động của các liên kết O-H hoặc N-H, ở 2917,06 và 2815 cm-1 là dao động của các liên kết hóa trị C-H; tại 1646,5 cm-1 (rất mạnh) là dao động của liên kết C=O amit bậc I; ở 1622 cm-1
là dao động của liên kết olefin (C=C), ở 1537,0 cm-1
là dao động biến dạng của liên kết NH amit; còn tại 1087,8 cm-1 là dao động của liên kết C-O-C và ở 651 cm-1 là dao động biến dạng của liên kết C-H (trang 51).
Qua việc phân tích các số liệu phổ 1
H-NMR (trang 52), 13C-NMR, DEP T- 135, DEPT-90 (trang 53), HSQC (trang 55) và HMBC (trang 56) của nó, có thể thấy hợp chất này có chỉ chứa một gốc đường -D-glucopyranoza, có nguyên tử H- 1'' ở H 4,2 ppm (1H, d, JH-1"-H-2" 7,8Hz), và phần genin là một gốc ceramit. Từ các phổ DEPT-90 và DEPT-135 cho biết, trong toàn bộ phân tử RTtE3 có 15 nhóm CH (các nguyên tử C có độ dịch chuyển hóa học C ở: 53,1; 69,6; 71,8; 71,9; 73,2; 75,9; 76,1; 102,8; 128,9; 128 - 131 ppm), trong đó có 5 nhóm metin (CH) là thuộc của phần đường -D-glucozơ, 7 nhóm metin (CH) là thuộc của các C olefin, 3 nhóm metin còn lại trong phần genin, thì 1 thuộc nhóm CH liên kết trực tiếp với N có C ở 53,1 ppm, 2 nhóm metin kia thuộc phần genin liên kết trực tiếp với oxi. Ngoài ra, phổ DEPT-135 của nó còn cho biết thêm, trong RTtE3 còn có 2 nhóm metylen (CH2) liên kết trực tiếp với O, một C-6’ ở 61,1 ppm (C-6’’) là nhóm CH2 thuộc phần đường, còn một tại C-1 ở 68,2 ppm (C-1) là nhóm CH2 thuộc nhánh aminoancol trong phần genin.
Hình 3.2 Phổ 1
Hình 3.4 Phổ 1
Trong phổ 1
H-NMR, có thể quan sát thấy độ dịch chuyển hóa học ( H) của một nguyên tử Ha ở 7,35 ppm (d, JHa-H2 =9,1Hz) đây là tín hiệu của nguyên tử Ha (NH) thuộc amit bậc 1, rất phù hợp với dao động hóa trị của liên kết CO amit ở tần số max=1646,5 và 1537 cm-1 trong phổ FT-IR, đồng thời cũng quan sát thấy có sự tương tác xa giữa nguyên tử Ha (NH) trong nhóm amit này với nguyên tử C-1’ trong nhóm carbonyl có C ở 175,2 ppm và với nguyên tử C-2 trong nhóm metin (CH) cận kề. Theo phổ HMQC của chất (RTtE3), thì một nguyên tử H có H ở 4,2 ppm, d, JH-H = 7,8 Hz có thể khẳng định đây là H-1" thuộc phần đường -D- glucozơ, có thể quan sát thấy tương tác xa giữa nó và nguyên tử C-1 của gốc aminoancol trong phần genin và C-2" trong phần đường. Các độ dịch chuyển hóa học ( H) của các nguyên tử H thuộc các nhóm metin trong phần đường có H nằm trong khoảng 3,2 – 3,75 ppm. Một nguyên tử H có H ở 3,9 ppm thuộc nhóm metin (CH), đây là nguyên tử H-2, cũng có thể quan sát thấy tương tác xa của nó với các nguyên tử C-1 và C-3 trong phổ HMBC. Còn nguyên tử H có H ở 3,85 ppm, chính là H-3 trong phần aminoancol và cũng có thể quan sát thấy tương tác xa giữa nguyên tử H này với các nguyên tử C-2 và C-4 trong phổ HMBC.
Trong phổ 1
H-NMR và HSQC của RTtE3 còn cho thấy các nguyên tử H có
H ở 0,87 ppm, đây là các nguyên tử H của 2 nhóm metyl (CH3) trong phần genin. Ngoài ra, nguyên tử H có H ở 3,70 và 3,85ppm, chính là các nguyên tử H-1a,b mà trong phổ HMBC cũng có thể quan sát thấy tương tác xa với C-1" trong phần đường có C-1’ ở 102,8 ppm và với C-2 (53,1 ppm) trong phần genin, và còn rất nhiều pic nằm trong khoảng 1,25- 2,5 ppm trong phổ 1
H-NMR là thuộc về các nguyên tử H thuộc các nhóm metylen (CH2) trong phần genin của phân tử RTtE3.
Những nguyên tử H có độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng 5,25 – 5,35 ppm là thuộc các nguyên tử H của các nhóm metin (CH) trong các liên kết olefin, có từ 3-4 liên kết olefin trong phần genin. Tương tác xa giữa các nguyên tử H olefin này với các nguyên tử C trong phần genin của RTtE3 cũng có thể quan sát
thấy trong phổ HMBC của nó (Xem các phổ của RTtE3 ở các trang 51, 52, 53, 54, 55, 56 ).
Những độ dịch chuyển hoá học đáng chú ý của typhtrilozit A được liệt kê ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Độ dịch chuyển hóa học của Typhotrilozit A (CD3OD/CDCl3)
C Ca,b Ha,c (J, Hz) 1H-1H COSY HMBC (H ↔ C)
Phần aminoancol NH - 7.35 d (9.1) H-2 C-1, 2, 3, 1′, 2′ 1a 1b 68.2 t 3.85 dd (6.1, 12.5) 3.70 dd (6.0, 12.8) H-1b, 2 H-1a, 2 C-2, 3 C-2, 3 2 53.1 d 3.9 m H-1a, 1b, 3, NH C-1’, 3, 4 3 71.8 d 3.85 dd, (3.2, 4.5) H-2, H-4 C-1, 2, 4 4 130.9 d 5.25 m H-3, 5a, 5b C-2, 3 5 128.9 d 5.35 m H-4, 6 C-3,4,6 6- 26 21.5 -32.4 t 1.26 br s 27 13.2 q 0.87 t (8.7) H-13 Phần axit 2-hidroxicacboxylic 1′ 175.2 s - 2′ 71.9 d 3.30 dd, (8.0, 3.7) H-3′a, 3′b C-1′, 3′ 3′a 3′b 34.3 t 2.00 m 2.20 m H-2′, 4′ H-2′, 4′ C-1′, 2′ C-1′, 2′ 4′-22′ 22.5-32.4 t; 128-131 1.26 br s 23′ 13.2 q 0.89 t (8.7) H-25′ Phần đường 1′’ 102.8 d 4.2 d (7.8) H2’’ C2’’ 2′’ 73.2 d 3.2 m H1’’,3’’ C1’’,3’’ 3′’ 75.9 d 3.25 m 4′’ 69.6 d 3.2 m 5’′ 76.1 d 3.3 m 6’’ 61.1 t 3.6 dd, (11.6; 2.15) 3.75 dd, (11.7; 5.36) H5’’ C5’’
Hợp chất RTtE3 được thủy phân bằng axit HCl 1M trong metanol, thu được một este metyl- 2-hidrocacboxylat (RTtE3.1). Phổ EIS/MS của nó cho pic phân tử là 380 (M+) phù hợp với công thức phân tử C24H44O3. Phổ 1H-NMR cho biết một số độ dịch chuyển hóa học đặc trưng của một số nguyên tử H như: 4,06 (H, t, H-2), 3,79 (3H, s, CH3-O), 0,89 (3H, t, 8,7); 5,2-5,65 (m, H-olefin). Còn từ phổ 13C-NMR của nó có thể khẳng định được một số nguyên tử C có độ dịch chuyển hóa học như sau: 179,7 (C-1’); 127,9;128,1; 130,1 và 130,2 (C-olefin); 70,4 (C-2’); 56,0 (CH3-O); 34,7 (C-3’); 21,4-30,9 (C- metilen); 14,4 (C-23’). Ngoài ra, còn thu được một aminoancol (RTtE3.2) mà từ phổ EIS/MS của nó cho pic phân tử là 459 (M+
) (xem phần phụ lục).
Qua các phân tích tổng hợp các số liệu phổ của RTtE3 như trên, có thể khẳng định chất RTtE3 là một cerebrozit, chúng tôi đặt tên cho nó là typhotrilozit A, và có thể đây là một chất mới lần đầu tiên phân lập được từ cây Bán hạ ba thùy. Công thức của hợp chất này có dạng sau.
R2NH NH R1 O OH O 1 2 3 1' 2' O H HO H HO H H OH H OH R 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6''
Do thời gian và khối lượng mẫu thực nghiệm còn ít, vì vậy để xác định cấu trúc hóa học hoàn thiện của cerebrozit này cần làm thực nghiệm với khối lượng mẫu nhiều hơn (khoảng 4-5kg) để thu được khối lượng chất RTtE3 đủ cho làm các thực nghiệm hóa lý (đo thêm các loại phổ như NMR, HR-FAB/MS và các loại phổ khác ..., tiến hành thực hiện các phản ứng hóa học như acyl hóa, thủy phân giáng vị để thu được các thành phần xây dựng lên phân tử RTtE3 như phần đường, phần genin gồm nhánh aminoancol và nhánh axit béo) nhằm thu thập các thông tin đầy đủ và cần thiết cho việc nhận dạng hợp chất typhotrilozit A.
KẾT LUẬN
1. Lần đầu tiên, cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) mọc hoang dại ở Việt Nam được nghiên cứu sàng lọc hoá thực vật. Đã xác định được tên khoa học và phương pháp ngâm chiết hợp lý.
2. Từ thân, lá và rễ cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum), đã phân lập được các lớp chất gồm: các axit béo no và không no, các hợp chất phytosterol, terpen- glycozit và cerebrozit.
3. Đã xác định được cấu trúc hóa học của 5 axit béo (axit palmitic, axit 11,14- octadecadienoic, axit 9,12-octadecadienoic, axit cis-linoleic, axit docosanoic), ba hợp chất phytosterol và glycozit của chúng ( -sitosterol, stigmasterol, 3-O- -D- glucopyranosyl-stigmasterol), khẳng định được một hợp chất tecpen-glycozit (RTtE1).
4. Lần đầu tiên 1 hợp chất cerebrozit (Typhotrilozit A) được phân lập từ cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum), cấu trúc hóa học cơ bản của nó đã được khẳng định bằng các hằng số vật lý và các số liệu phổ hiện đại như: IR, MS, NMR với các kỹ thuật phổ 1D và 2D. Để khẳng định cấu trúc chính xác của nó cần có những nghiên cứu tiếp theo (vị trí các liên kết đôi, cấu hình tuyệt đối R,S, ... của phân tử). Đây là lớp chất có nhiều hoạt tính sinh học lý thú đóng vai trò quan trọng cho sự sống.