Nguyên tắc
Cho protease tác dụng với cơ chất là casein, sản phẩm tạo thành là các peptide ngắn hay các loại acid amin. Trong các loại acid amin, tyrosine chiếm đa số. Xác định tyrosine bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, từ đĩ xác định hoạt tính enzyme protease theo định nghĩa:
Hoạt tính protease đƣợc biểu thị là số micromol tyrosine sinh ra do thủy phân casein bởi 1 mg hỗn hợp chứa protease trong 1 phút ở điều kiện chuẩn (35,5o C, pH= 7,6)
Hĩa chất
Dung dịch Na2HPO4 1/15 M: hịa tan 2,967 g Na2HPO4.2H2O trong nƣớc thành 250 ml.
Dung dịch KH2PO4 1/15 M: hịa tan 0,9072 g KH2PO4 trong nƣớc thành 100 ml.
Dung dịch đệm Sorosen 1/15 M, pH 7,6: trộn 177 ml dung dịch Na2HPO4 1/15 M và 23 ml dung dịch KH2PO4 1/15 M. Đo và chỉnh lại pH cho đúng.
Dung dịch casein 1 %: đun sơi cách thủy 1 g casein trong đệm Sorensen cho đến tan hồn tồn rồi định mức bằng Sorensen cho đủ 100 ml.
Dung dịch TCA 10 %: hịa tan 10 g TCA trong nƣớc cho đủ 100 ml. Dung dịch NaOH 0,5 N: hịa tan 10g NaOH trong nƣớc cho đủ 500 ml. Dung dịch HCl 0,2 N: trộn 4,25 ml HCl đậm đặc với nƣớc cho đủ 250 ml.
Dung dịch tyrosine 20 mM/l: khuấy nghiền 0,118 g tyrosine trong dung dịch HCl 0,2N vừa đủ 50 ml.
Dung dịch tyrosine chuẩn 1 mM/l: pha lỗng 5 ml tyrosine 20 mM/l trong HCl 0,2 N thành 100 ml.
Tiến hành
Bảng 3.2 Xây dựng đƣờng chuẩn tyrosine
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5
Dung dịch tyrosine chuẩn 1 mM/l (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Dung dịch HCl 0,2 N (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Dung dịch NaOH 0,5 N (ml) 2 2 2 2 2 2 Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 Lƣợng tyrosine (µ mol) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Lắc và để yên 10 phút đem đo mật độ quang ở bƣớc sĩng 660 nm. Vẽ đồ thị biễu diễn sự biến thiên mật độ quang (ΔOD) theo lƣợng tyrosine ở các ống.
Bảng 3.3 Xác định lƣợng tyrosine trong dung dịch nghiên cứu Dung dịch hĩa chất Ống nghiệm Thử thật (3 ống) Thử khơng (3 ống) casein 1% (ml) 5 5 TCA% (ml) 0 5 Dịch enzyme mẫu (ml) 1 0
Lắc đều và giữ ở 35,5oC, trong 30 phút
TCA 10% (ml) 5 0
Dịch enzyme mẫu (ml) 0 1
Lọc, lấy 1ml dịch lọc thực hiện phản ứng màu
Dịch lọc (ml) 1 1
Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2 2
Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6
Lắc đều, để yên 10 phút, đo OD ở bƣớc sĩng 660nm Cách tính
Hoạt tính enzyme protease (UI)
x: số µmol tyrosine suy ra từ đƣờng chuẩn
V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng enzyme (11 ml) v: thể tích dịch lọc đem phân tích (1 ml)
k: độ pha lỗng mẫu t: thơì gian phản ứng
1UI (Anson)= 1 micromol tyrosine/ml/phút; hoặc = 1 micromol/mg/phút Hoạt tính đặc hiệu của enzyme protease (UI/mg)
Từ kết quả hàm lƣợng protein (mg/ml) và hoạt tính enzyme protease (UI/ml). Tính hoạt đặc hiệu của enzyme (htđh):
HT (UI) = (x.V.K)/(t.v)
Số đơn vị hoạt tính mg protein enzyme HTĐH =
3.3.2.3. Thí nghiệm tinh sạch enzyme bromelain bằng sắc ký trao đổi ion
Hình 3.1 Hệ thống sắc ký tinh sạch protein áp suất cao BioLogic Duo-Flow
(Xem chú thích các bộ phận và thơng số chính của hệ thống BioLogic Duo-Flow ở phần phụ lục 3)