trƣởng
Cây dứa tái sinh từ ĐST ở Nội dung 1 được kiểm tra virus PMWaV-1 và PMWaV-2 bằng kĩ thuật RT-PCR.
3.4.1. Vật liệu
Mẫu kiểm tra
Mẫu lá của chồi dứa in vitro tái sinh từ đỉnh sinh trưởng.
Thiết bị và dụng cụ Máy điện di Máy PCR Máy ly tâm Tủ lạnh -200C, tủ mát 40 C Pipet, cối nghiền mẫu...
Hóa chất
Kit tách chiết RNA: Arum Total RNA Mini Kit (Bio- rad). Primer chuyên biệt để nhận biết PMWaV-1 và PMWaV-2. Primer đặc trưng cho PMWaV-1 có trình tự như sau:
5’-ACAGGAAGGACAACACTCAC-3’ 5’-CGCACAAACTTCAAGCAATC-3’
Primer đặc trưng cho PMWaV-2 có trình tự như sau: 5’-CATACGAACTAGACTCATACG-3’ 5’-CCATCCACCAATTTTACTAC-3’ Access RT-PCR kit (Promega)
Tris-Acetic acid-EDTA (TAE) 0,5X
3.4.2. Phƣơng pháp tiến hành Ly trích RNA tổng số Ly trích RNA tổng số
Sử dụng qui trình ly trích RNA theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Phụ lục 2) để thu RNA tổng số. Dịch ly trích RNA được sử dụng trong các phản ứng RT-PCR. RNA của PMWaV (nếu có) sẽ được khuếch đại nhờ các primer đặc hiệu với đoạn gen HSP 70 của virus. Sản phẩm khuếch đại RT-PCR được thể hiện trên gel điện di. Nhuộm ethidium bromide và chụp hình gel bằng tia UV để đọc kết quả.
Thực hiện RT-PCR
Bƣớc 1: chuẩn bị hỗn hợp phản ứng. Các hoá chất cần chuẩn bị như sau: Nuclease –free light mineral oil (Sigma Cat # M5904)
Hỗn hợp phản ứng (reaction mix)
Bảng 3.3 Thành phần mix phản ứng RT - PCR
Thành phần mix RT - PCR Thể tích sử dụng
Nuclease – Free water X l
MMV/Tfl 5X ( ủ ở 650C 15 phút trước khi pha) 10 l
dNTP (*) 1 l
Primer xuôi và ngược (**) 50 pmol/loại
25 nM MgSO4 (*) 2 l AMV RT ( 5 u / l ) 2 l Tfl DNA polymerase ( 5 u / l ) 1 l Dịch ly trích RNA 2 l Thể tích cuối V = 50 l Ghi chú:
(*) Vortex trước khi sử dụng
(**) Primer đặc trưng cho HSP 70 của PMWaV-1,2 do IDT (Intergrated of DNA technologies, USA) cung cấp
Pha mix trong tube 0,5 ml và trộn đều bằng pipet. Sau khi thêm AMV RT và Tfl DNA polymerase vào, vortex hỗn hợp trong 10 giây.
Phủ lên mỗi tube 1- 2 giọt Nuclease – free mineral oil. Đặt tube vào bồn giữ nhiệt ủ ở 450C trong 45 phút.
Cài đặt chương trình nhiệt cho phản ứng RT-PCR một bước gồm quá trình tổng hợp cDNA và khuếch đại RNA.
Chu kì nhiệt cho phản ứng
Giai đoạn 1 (thực hiện phiên mã ngược)
Tổng hợp sợi cDNA : 450C/ 45 phút (1 chu kì); 940C/2 phút (1 chu kì) Giai đoạn 2 (phản ứng PCR)
cDNA được khuếch đại theo chương trình nhiệt sau:
920C/30 giây, 580C/1 phút, 680C/90 giây (10 chu kì); 920
C/30 giây, 540C/1 phút, 680C/90 giây (35chu kì).
680C/8 phút (1 chu kì).
Điện di sản phẩm
Chuẩn bị hỗn hợp điện di 5 l/ giếng (3,5 l mẫ + 1,5 l loading dye)
Load hỗn hợp lên gel agarose 1,5% và chạy điện di trong 60 phút ở 50V cho đến khi vạch màu loading dye chạy đến 2/3 chiều dài gel.
Buffer điện di là TAE 0,5X.
Nhuộm Ethidium bromide 15 phút và chụp hình gel dưới tia UV và đọc kết quả.
Mẫu kiểm tra
Gồm 12 mẫu lá của chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST như sau:
Bảng 3.4 Các mẫu lá của chồi dứa tái sinh từ ĐST được kiểm tra PMWaV bằng kĩ thuật RT-PCR
Giống Xử lí nhiệt Số mẫu kiểm tra
TQ - 1 TL - 1 LĐ - 1 TQ + 3 TL + 3 LĐ + 3
Ghi chú: TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng; (-): không xử lí nhiệt, (+): xử lí nhiệt.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Khảo sát khả năng tái sinh của ĐST nuôi cấy trên môi trƣờng MS 4.1.1 Thời gian tái sinh
Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến thời gian tái sinh (TGTS) của ĐST chồi dứa Cayenne như sau:
Bảng 4.1 Ảnh hưởng các yếu tố giống, xử lý nhiệt và kích thuớc mẫu đến TGTS của ĐST chồi dứa Cayenne
Yếu tố ảnh hƣởng Nghiệm thức TGTS trung bình (ngày)
Giống TQ 1, 4, 7, 10 12,56a TL 2, 5, 8, 11 12,78a LĐ 3, 6, 9, 12 12,56a Xử lí nhiệt - 1, 2, 3, 7, 8, 9 12,50 a + 4, 5, 6, 10, 11, 12 12,76a Kích thƣớc mẫu (mm) 0,3 – 0,5 1, 2, 3, 4, 5, 6 13,44b 0,5 – 1 7, 8, 9, 10, 11, 12 11,81a Ghi chú:
TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng (-): không xử lí nhiệt, (+): xử lí nhiệt
Trong cùng một yếu tố ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05).
Kết quả Bảng 4.1 cho thấy sự khác biệt về thời gian tái sinh xét theo yếu tố giống và xử lí nhiệt là do sai số ngẫu nhiên (P 0,05). Sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê do ảnh hưởng của kích thước mẫu (P 0,05). Các nghiệm thức với kích thước mẫu từ 0,3 – 0,5 mm có thời gian tái sinh trung bình là 13 ngày trong khi với kích thước mẫu từ 0,5 – 1 mm thời gian tái sinh trung bình là 11 ngày. Nhìn chung thời gian tái sinh là 12,62 ngày (xem Phụ lục).
Trong các tương tác giữa các yếu tố ảnh hưởng, chỉ có tương tác giữa yếu tố giống – xử lí nhiệt và giống – kích thước mẫu ảnh hưởng đến thời gian tái sinh (P 0,05); các tương tác còn lại đều không có ý nghĩa (P 0,05). Tương tác giữa giống – xử lí nhiệt kéo dài thời gian tái sinh và mức độ ảnh hưởng khác nhau tùy theo giống. Tương tác giữa giống – kích thước mẫu làm thay đổi thời gian tái sinh trung bình. Tuy nhiên mẫu có kích thước từ 0,5 – 1 mm vẫn tái sinh sớm hơn so với mẫu có kích thước từ 0,3 – 0,5 mm.
Hình 4.1 Chồi dứa trước khi tách ĐST và ĐST được tách quan sát dưới kính hiển vi soi nổi SZ40