Nồng độ ôxy: Nấm Hương thuộc nhóm nấm hoại sinh và hiếu khí, vì vậy
trong quá trình nuôi hệ sợi nấm Hương nên bổ sung ôxy bằng thiết bị lắc, khuấy hay sục khí.
Theo nghiên cứu của Hassegawa trong môi trường nuôi cấy lỏng với sự cung cấp ôxy thông qua chế độ nuôi có lắc và không lắc (nuôi tĩnh) sử dụng môi trường YEM ở nhiệt độ 25oC. Khi nuôi cấy tĩnh chỉ thu được hàm lượng sinh khối sợi khô của nấm Hương tối đa là 4mg/ml. Trong khi nuôi cấy có lắc với tốc độ 150 vòng/phút thì hàm lượng sinh khối sợi khô của nấm Hương tăng lên 5mg/ml [9].
Nhiệt độ môi trường: Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của hệ sợi nấm Hương. Sợi nấm phát triển ở dải nhiệt độ từ 5 đến 35oC nhưng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ từ 20 đến 25oC. Đây là nhiệt độ phù hợp với điều kiện khí hậu ở nhiều vùng của nước ta. Còn dưới nhiệt độ 10oC và trên nhiệt độ 32oC
sự sinh trưởng của hệ sợi nấm bị hạn chế. Đến nhiệt độ 35oC sợi nấm bắt đầu ngừng phát triển [1].
Độ pH môi trường: Trong nuôi cấy lỏng, theo nghiên cứu của Hassegawa
và CS thì pH tối ưu cho sợi nấm Hương phát triển trên môi trường dung dịch là 4,5 [9].
Cường độ ánh sáng: Ánh sáng không ảnh hưởng nhiều đến quá trình phát
triển hệ sợi. Khi nuôi trên môi trường thạch đĩa, thường nuôi ở trong tủ ấm, không có ánh sáng, hệ sợi nấm Hương vẫn phát triển tốt. Đối với nuôi cấy môi trường lỏng (trong thiết bị lên men) thì thường sử dụng nuôi ở ánh sáng phòng hay trong tối [22].
Phần III
ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Các chủng nấm Hương nghiên cứu đều do Viện Di truyền nông nghiệp cung cấp.
1. Chủng nấm Hương Ld có nguồn gốc xuất xứ từ Ý.
2. Chủng nấm Hương Lg có nguồn gốc xuất xứ từ Trung Quốc. 3. Chủng nấm Hương Lc có nguồn gốc xuất xứ từ Cao Bằng.
3.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất tiến hành
` a) Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
- Cân phân tích.
- Máy quang phổ tử ngoại – khả biến U-1800 của Nhật Bản. - Máy ly tâm HERMLE Z300 của Đức.
- Máy lắc ORBIT 1900 của Nhật Bản. - Tủ cấy vi sinh vật.
- Tủ sấy mẫu.
- Tủ ấm nuôi cấy vi sinh vật.
- Dụng cụ thủy tinh các loại: đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác 250ml, ống đong, phễu, cốc, đũa thủy tinh, Micropipet loại 1 ml và 0,2ml.
- Các dụng cụ khác như bông thấm nước, bông không thấm nước, đèn cồn, giấy báo, nồi nấu, dao thái, giấy đo pH, thang đo pH.
b) Hóa chất nghiên cứu
- Hóa chất bổ sung môi trường: axít lactic, đường glucose, cám gạo,.... - Hóa chất phân tích β-glucan: D-glucose tinh khiết, phenol, axít sulfuric 96%, cồn 96o.
c) Môi trường nuôi cấy
- Môi trường thạch PDA: 200g khoai tây, 20g glucose, 20g agar. Tính cho 1 lít.
- Môi trường lỏng PDR: 200g khoai tây, 20g glucose, 25g cám gạo. Tính cho 1 lít.
3.1.3. Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm - Trung tâm Nghiên cứu và Kiểm tra chất luợng nông sản thực phẩm - Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch.
Địa chỉ: Số 4 - Ngô Quyền - Hà Nội.
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu so sánh sự phát triển sinh khối của một số chủng nấm Hương trên môi trường thạch PDA.
- Nghiên cứu so sánh sự phát triển sinh khối của một số chủng nấm Hương trong môi trường lỏng PDR.
- Xác định và so sánh hàm lượng β-glucan trong sinh khối sợi nấm ở một số chủng nấm Hương phát triển trong môi trường nuôi cấy lỏng.
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
3.3.1.1. Thí nghiệm nghiên cứu so sánh khả năng phát triển của các chủng nấm Hương khác nhau trên môi trường thạch PDA
Tiến hành nuôi cấy các chủng nấm Hương khác nhau trên môi trường thạch PDA, pH trong khoảng 5, nhiệt độ môi trường nuôi cấy trong tủ ấm là 25oC. Sau đó, xác định đường kính phát triển hệ sợi nấm của các chủng giống sau từ 3 đến 9 ngày nuôi cấy. Từ kết quả thu được đánh giá tốc độ phát triển của các chủng nấm Hương trên môi trường thạch đĩa để kết luận chủng giống nào phát triển tốt nhất trên môi trường rắn làm cơ sở cho sự nghiên cứu phát triển của các chủng giống này trong môi trường nuôi cấy lỏng tiếp theo.
Nhân và làm sạch giống trên đĩa thạch: Tiến hành nhân giống trên đĩa thạch từ ống giống. Chuẩn bị 5 đĩa/giống x 3 giống = 15 đĩa.
So sánh theo sinh khối trên đĩa thạch: Sau khi nhân giống 10 ngày, tiến hành nghiên cứu so sánh khả năng phát triển của 3 chủng nấm Hương trên môi trường thạch PDA thông qua đo đường kính hệ sợi nấm. Chuẩn bị 5 đĩa/giống x 3 giống = 15 đĩa.
3.3.1.2. Thí nghiệm nghiên cứu so sánh khả năng phát triển sinh khối của các chủng nấm Hương trong môi trường lỏng PDR
Tiến hành cấy chuyển từ các đĩa thạch đã được bảo quản ở 5oC sau 10 ngày nhân giống như đã nêu ở mục 3.3.1.1 sang môi trường lỏng PDR. Chuẩn bị 5 bình/giống x 3 giống = 15 bình. Nuôi cấy ở cùng điều kiện của môi trường phòng thí nghiệm (20 - 30oC), pH trong khoảng 4 - 5, tốc độ lắc 120 vòng/phút (lắc 8 giờ/ngày chia làm 2 lần). Lấy mẫu để xác định khối lượng sinh khối khô vào ngày 22. Kết quả cần xác định là khả năng phát triển sinh khối của các
chủng giống để xem chủng nào có khả năng phát triển tốt nhất trong môi trường lỏng.
3.3.1.3. Thí nghiệm phân tích hàm lượng β-glucan trong sinh khối ở các chủng nấm Hương
Để đánh giá hàm lượng β-glucan trong sinh khối sợi của 3 chủng nấm Hương Ld, Lg, Lc tiến hành thu sinh khối sợi nấm khô từ 3 chủng ở mục 3.3.1.2 và phân tích hàm lượng β-glucan trong sinh khối. Số lượng mẫu bố trí là 3 giống x 3 lần lặp = 9 mẫu phân tích. Từ kết quả thu được đánh giá chủng nấm nào cho hàm lượng β-glucan cao nhất.
3.3.2. Phương pháp chuẩn bị môi trường
3.3.2.1. Phương pháp chuẩn bị môi trường thạch đĩa PDA
Chuẩn bị khoai tây (đã gọt vỏ, cắt nhỏ) 200g + 20g glucose + 20g thạch agar và nước cho đủ 1 lít.
Khoai tây (đã gọt vỏ, cắt nhỏ) 200g đun sôi đến chín kỹ rồi lọc qua vải lọc 2 lần. Sau đó mới thêm 20g glucose + 20g thạch agar, bổ sung cho đủ 1 lít rồi đun cho tan thạch. Điều chỉnh pH trong khoảng 5 bằng axít lactic. Phân vào các bình tam giác, đậy nút bông rồi hấp khử trùng ở điều kiện nhiệt độ 121oC, áp suất 1at trong 20 phút. Sau khi khử trùng môi trường để nguội xuống khoảng 50oC tiến hành đổ vào đĩa Petri vô trùng khoảng 20ml/đĩa (ф 9) rồi dùng tay xoay tròn cho môi trường dàn đều trong đĩa. Sau đó đậy nắp để thạch đông thì lật ngược lại cho vào tủ ấp. Sau 2 ngày kiểm tra đĩa thạch nào bị nhiễm mốc xanh hay đen thì loại bỏ. Các đĩa sử dụng phải vô trùng mới mang đi cấy giống nấm.
3.1.2.2.Phương pháp chuẩn bị môi trường nuôi cấy lỏng PDR
Môi trường PDR (200g khoai tây, 20g glucose, 25g cám gạo. Tính cho 1 lít): Khoai tây gọt vỏ cắt nhỏ được 200g định mức 1 lít nước đem đun chín kỹ
rồi bổ sung 25g cám gạo vào và khuấy đều. Đem lọc qua vải lọc 2 lần rồi lọc tiếp bằng vải lọc malt 2 lần. Sau đó định lượng đến 1 lít, bổ sung 20g đường glucose. Đun nóng cho tan đường rồi điều chỉnh pH đến khoảng 4 - 5. Phân vào các bình tam giác dung tích 250ml, mỗi bình 100 ml rồi tiệt trùng ở 121oC, áp suất 1at trong 30 phút.
3.3.3. Phương pháp nuôi cấy 3.3.3.1. Phương pháp đặt thạch
Thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Dùng que cấy móc, khử trùng bằng dung dịch cồn 70oC và hơ trên ngọn lửa đèn cồn. Khi móc nguội dùng lấy sợi nấm trong ống nghiệm giống gốc rồi chấm vào 3 điểm trên đĩa thạch. Sau đó lật ngược lại nuôi trong tủ ấm với nhiệt độ 25oC. Sau 10 ngày khi sợi nấm phát triển rộng thì tiến hành đục lỗ thạch (nơi có sợi nấm phát triển) bằng cái đục tròn rỗng có đường kính 5mm. Dùng kẹp đã khử trùng gắp mảng thạch đường kính 5mm đó đặt vào tâm đĩa thạch khác và tiếp tục nuôi ở nhiệt độ 25oC trong tủ ấm. Theo dõi sự phát triển thông qua đo đường kính của hệ sợi nấm.
3.3.3.2. Phương pháp nhân nuôi chủng nấm Hương trong môi trường lỏng
Cấy chuyển sang môi trường lỏng: Tiến hành trong tủ cấy vô trùng, đục lỗ thạch bằng dụng cụ đục lỗ có đường kính 5mm như đã nêu ở mục 3.3.3.1, gắp cho vào mỗi bình 5 miếng thạch. Đậy nút bông và đặt trên máy lắc. Nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 25oC, tốc độ lắc 120 vòng/phút (8h/ngày), trong 22 ngày.
3.3.4. Phương pháp xác định lượng sinh khối tươi và khô
Sử dụng loại giấy lọc có đường kính 9mm, sấy vải lọc ở nhiệt độ 120oC trong thời gian 4h. Sau đó để nguội trong bình hút ầm có silicagel. Cân các giấy lọc để biết khối lượng của chúng. Dùng các giấy lọc đó để lọc sinh khối từ các bình tam giác sau khi nuôi cấy. Dùng phễu để đỡ tờ giấy lọc. Sau khi chảy hết môi trường qua giấy lọc sẽ đem sấy sinh khối cùng giấy lọc. Sấy ở nhiệt độ 60oC
trong 18h rồi đem để nguội trong bình hút ẩm trước khi cân. Tính toán khối lượng sinh khối khô thông qua chênh lệch khối lượng. Lượng sinh khối được tính theo mg trên 1 ml môi trường. Giá trị trung bình được tính từ 5 mẫu song song.
3.3.5. Phương pháp phân tích hàm lượng β-glucan
Theo nghiên cứu của Manzi và Pizzoferrato hàm lượng β-glucan trong nấm Hương khoảng 0,22g/100g chất khô [19]. Như vậy, để tách chiết và phân tích được lượng β-glucan trong nấm Hương là rất khó, yêu cầu thiết bị hiện đại. Mặt khác theo nghiên cứu ở Mỹ hàm lượng glucan tổng số tách chiết từ thành tế bào nấm men bánh mỳ thu được là 80%, trong đó β-glucan chiếm khoảng 50% [6]. Như vậy, để đánh gía hàm lượng β-glucan hoàn toàn có thể tiến hành thông qua đánh giá hàm lượng glucan tổng số.
3.3.5.1. Chiết xuất β-glucan từ sinh khối sợi nấm khô
Sử dụng sinh khối sợi nấm khô thu được từ thí nghiệm ở mục 3.3.1.2 tiến hành phân tích xác định hàm lượng glucan ở các chủng nấm Hương. Cân 100 mg sinh khối khô và 10 ml nước cất đem hấp ở nhiệt độ 121oC, áp suất 1at trong 15 phút. Sau đó ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút. Lọc qua giấy lọc whatman. Dịch lọc thu được pha trộn với 4 lần ethanol 96%, lắc mạnh và để qua đêm ở 4 oC. Sau đó ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 10 phút. Phần nổi lên được bỏ đi và phần huyền phù phía dưới được ủ với NaOH 1M ở 60 oC trong 1h [10]. Lượng glucan được xác định bằng phương pháp phenol-sulfuric.
Phương pháp phenol-sulfuric xác định glucan dựa trên việc hấp thụ tại bước sóng 490 nm của phức chất tạo bởi phenol và cacbohydrate. Hàm lượng glucan được xác định bằng cách so sánh với một đường chuẩn. Sử dụng máy quang phổ hấp thụ, chọn bước sóng 490 nm, xây dựng đường chuẩn, đo các mẫu phân tích. Tùy từng điều kiện phương pháp phenol-sulfuric có độ chính xác đến ± 2% [12].
3.3.5.2. Xây dựng đường chuẩn
Quy trình lập đường chuẩn glucan như sau:
- Pha phenol 4%: cân 4g phenol, hòa tan trong bình định mức 100ml bằng nước cất, sau khi phenol tan hết ta thêm nước cất đến vạch định mức. - Cân 1g D-glucose tinh khiết (chất chuẩn), hòa tan trong bình định mức
1lít bằng nước cất sau khi glucose tan hết ta thêm nước cất đến vạch định mức. Ta có dung dịch chuẩn với nồng độ 1mg/ml (1000ppm).
- Từ dung dịch chuẩn ta pha thành dãy chuẩn với các nồng độ: 0,2mg/ml; 0,1mg/ml; 0,05mg/ml; 0,02mg/ml; 0,01mg/ml; tương ứng với các nồng độ 200ppm; 100ppm; 50ppm; 20ppm; 10ppm.
- Lấy 5ml mỗi nồng độ chất chuẩn đưa vào các lọ 10ml.
- Thêm lần lượt vào tất cả các lọ chuẩn 0,5ml dung dịch phenol 4% sau đó thêm lần lượt vào tất cả các lọ 2,5ml dung dịch H2SO4 96%.
- Chuyển dãy chuẩn ra các cuvet và đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng là 490 nm.
3.3.5.3. Tính toán xác định hàm lượng glucan trong sinh khối sợi nấm khô
- Từ đường chuẩn xác định được nồng độ mẫu phân tích. - Hàm lượng glucan được tính theo công thức sau:
Hàm lượng glucan (%) = 100 ) ( 8 10 ) ( 3 × × × − g KLMPT g x
Trong đó: x là số gam xác định từ đường chuẩn 8 là hệ số pha loãng
KLMPT là khối lượng mẫu ban đầu đem phân tích = 0,1g - Giá trị trung bình được tính từ 3 mẫu song song.
3.3.6. Phương pháp xử lý thống kê
Phần IV
KẾT QUẢ - THẢO LUẬN