Cỏc chất thu được từ dịch chiết etylaxetat (ĐE) được phõn chia trờn sắc kớ cột với chất hấp phụ silicagel, rửa giải bằng hỗn hợp dung mụi clorofom- metanol với tỉ lệ metanol tăng dần từ 0% - 100% thu được nhiều phõn đoạn khỏc nhau trong đú cú phõn đoạn CHCl3:MeOH (9:1) chứa một chất sạch được kớ hiệu là chất ĐE-1.
Chất ĐE-1 là chất rắn, tinh thể hỡnh kim cú nhiệt độ núng chảy ở 2480 C-2500 C.
Phổ IR cho võn hấp thụ mạnh ở νmax= 1700cm-1 đặc trưng cho nhúm cacboxyl cú νmax = 1700cm-1, với võn rất tự cú số súng νmax = 3100cm-1 đặc trưng cho nhúm OH của phenol.
Phổ 1
H-NMR cho tớn hiệu 7,092ppm ứng với hai proton ở hai vị trớ C2 và C6.
Phổ 13
C-NMR cho thấy cỏc tớn hiệu: δC-1 = 121,960ppm; δC-4 =139,559 ppm; δC-2 = δC-6 =110,349ppm; δC-3 = δC-5 =146,345ppm; δC-7 =170,364ppm. Những số liệu về phổ NMR của chất ĐE-1 hoàn toàn phự hợp với phần mềm ACD/NMR của axit gallic (xem bảng 3.4).
Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của ĐE-1 và số liệu phổ NMR trong
phần mềm ACD/NMR của axit gallic
Vị trớ cacbon
Phổ của chất ĐE-1 Phần mềm ACD của axit gallic
13 C-NMR (δ-ppm) 1 H-NMR (δ-ppm) ACD/13C- NMR (δ-ppm) ACD/ 1H-NMR (δ-ppm) 1 121,96 - 123,88 - 2 110,35 7,092 111,35 7,11 3 146,35 - 147,44 - 4 139,56 - 138,18 - 5 146,35 - 147,44 - 6 110,35 7,092 111,35 7,11 7 170,36 - 167,37 -
51
Trờn cơ sở phõn tớch cỏc số liệu về phổ FT-IR, NMR và phần mềm ACD/NMR. Cấu trỳc của axit gallic là:
COOH OH HO OH 2 3 4 5 6 7 1 Axit gallic
Từ dịch chiết etylaxetat, ngoài axit gallic cũn thu được một số phõn đoạn khụng sạch khỏc cú chứa cỏc chất cho phản ứng màu với xianidin; cho phản ứng tạo màu xanh đen với FeCl3. Cỏc mẫu này cú chứa hỗn hợp cỏc flavonoit, cỏc polyphenol cú hệ số Rf rất gần nhau và việc tỏch chỳng bằng cột silicagen chưa đạt được sự phõn chia tốt.
Khi rửa giải bằng CH3OH 100% thu được phõn đoạn cho cỏc phản ứng màu giống dịch chiết tổng số bằng n-butanol. Khi thực hiện phản ứng thuỷ phõn cỏc mẫu này trong axit HCl 2N thu được glucozơ và axit gallic. Từ kết quả thuỷ phõn này cú thể cho rằng cỏc phõn đoạn chiết bằng etylaxetat và bằng n-butanol đều chứa cỏc tannin và đú là galotanin. Tuy nhiờn cỏc tannin ấy được tạo ra bởi liờn kết C-glycoside hay O-glycoside cấu trỳc và thứ tự liờn kết của chỳng như thế nào, cũn chưa được làm rừ vỡ chưa tỏch chỳng thành cỏc đoạn sạch.
52
53
54
55
56
3.4. Thử hoạt tớnh sinh học
Cỏc chất tổng số được chiết, tỏch bằng dung mụi cú độ phõn cực khỏc nhau sau khi làm khụ kiệt, loại bỏ hoàn toàn dung mụi được gửi tới phũng thớ nghiệm vi sinh trường Đại học Y khoa Thỏi Nguyờn để thử tỏc dụng sinh học của chỳng. Kết quả được nờu ở bảng 2.3 và hỡnh 2.1 cho thấy tất cả cỏc chất thu được từ cỏc dịch chiết của lỏ cõy đỏ ngọn đều cú tỏc dụng khỏng khuẩn đối với khuẩn Staphylococcus, E.coli, Salmonella typhi.
Chỳng tụi cũng đó gửi mẫu chiết bằng etylaxetat và chiết bằng etanol sau khi đó làm sạch dung mụi đến cơ sở sản xuất kinh doanh thuốc thành phẩm, thực phẩm chức năng Y học cổ truyền Thỏi Nguyờn. Cỏc mẫu đều cú tỏc dụng tốt đối với việc chăm súc sức khoẻ con người, cỏc chất cú trong cỏc dịch chiết trờn đều khụng gõy độc đối với con người.
57
KẾT LUẬN
1. Nghiờn cứu sàng lọc hoỏ thực vật của lỏ cõy đỏ ngọn (Cratoxylum
prunifolium) đó phỏt hiện thấy nhiều nhúm hợp chất thiờn nhiờn cú hoạt tớnh
sinh lý cao; đú là đường khử, tritecpenoit, steroit, saponin, cumarin, axit hữu cơ, cỏc flavonoit, cỏc chất polyphenol, cỏc tannin, cỏc chất xanthone.
2. Từ lỏ cõy đỏ ngọn lần đầu tiờn đó phõn lập và dựa vào cỏc đặc trưng hoỏ lý, cỏc số liệu phổ EI-MS, NMR, FT-IR đó nhận dạng được cấu trỳc của 4 hợp chất hữu cơ thuộc cỏc nhúm polyphenol, steroit, terpenoit.
3. Phõn tớch cỏc phổ IR, UV, MS và NMR cỏc chất tinh khiết được tỏch ra núi trờn đó nhận dạng được chỳng là: taraxeron, stigmasterol , β- sitosterol và axit gallic.
4. Từ dịch chiết tổng của lỏ đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium) chỳng hoàn toàn khụng gõy độc hại với con người, cú thể chế biến thành thức uống hằng ngày như một thực phẩm chức năng cú tỏc dụng khỏng cỏc khuẩn
Staphylococcusauresu (Tụ cầu vàng), E.coli (Thực khuẩn đường ruột) và
Salmonella typhi (Thương hàn).
KIẾN NGHỊ
Cõy đỏ ngọn là một cõy thuốc quý cú nhiều tỏc dụng trong y học vỡ vậy tụi đề nghị với cỏc cấp cú thẩm quyền tiếp tục cho nghiờn cứu một cỏch sõu rộng hơn về cõy đỏ ngọn nhằm phục vụ tốt trong đời sống nhõn dõn.
58
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng việt
1. Vừ Văn Chi (1999), Từ điển cõy thuốc Việt Nam, Nxb Y học, trang 969. 2. Trần Đỡnh Đại (1998), “Khỏi quỏt về hệ thực vật Việt Nam”, Hội thảo
Việt - Đức về hoỏ học cỏc hợp chất thiờn nhiờn, Hà Nộ i, trang 17-27. 3. Nguyễn Văn Đàn (1997), Cỏc phương phỏp nghiờn cứu cõy thuốc, Nxb
Y-Dược, TP Hồ Chớ Minh .
4. Đề tài cấp bộ quốc phũng của Học viện Quõn Y (2002) , “Nghiờn cứu tỏc dụng của dịch chiết từ cõy đỏ ngọn lờn một số chức năng của hệ thần kinh trờn động vật thực nghiệm”, Hà Nội
5. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cõy cỏ Việt Nam, Nxb Trẻ, Hà Nội.
6. PGS.TS Phạm Đỡnh Hựng (2007), Nghiờn cứu xỏc định cấu trỳc cỏc hợp
chất cú hoạt tớnh sinh học cao, (Mó số đề tài 510402).
7. Hoàng Thanh Hương, Cầm Thị Ích, Hà Việt Sơn (2006), Khảo sỏt phần
dịch chiết etylaxetat của lỏ thành ngạnh, tạp chớ Hoỏ học, T.44(1), trang
71-75.
8. Lờ Khả Kế (1977), Cõy cỏ thường thấy ở Việt Nam, tập 2, Nxb Khoa học và kỹ thuật, trang 189.
9. Nguyễn Liờm, Triệu Duy Điệt, Đỗ Văn Bỡnh (1996), Nghiờn cứu tỏc dụng
chống oxi hoỏ (Antioxidant invitro) của một số cõy thuốc Việt Nam, Cụng
trỡnh nghiờn cứu khoa học quõn sự số 3, trang 30-33.
10. Nguyễn Liờm và cộng sự (1996), “Nghiờn cứu tỏc dụng chống oxi hoỏ (antioxydant), của cõy đỏ ngọn để phũng và chứa cỏc bệnh về rối loạn huyết động”. Đề tài cấp Bộ quốc phũng, Hà Nội.
11. Đỗ Tất Lợi (2001), Những cõy thuốc Việt Nam, Nxb Y học, trang 122-123. 12. Trần Cẩm Vinh (1997), “Tỏc dụng của cõy đỏ ngọn trong quỏ trỡnh đụng
59
Tiếng Anh
13. A.K.Ratty, N.P.Das (1988), “Biochemical medicine and metabolic biologo”, 39, 69-79.
14. Anake Kijjoa, Maria Jose, T.G.Gonzalez, Madalena M.M.Ana M.Damas, ĐIng-on Mondranondra, Llartur M.S.Silva and Werner Herz (1998), “Xanthones from Cratoxylum Maingayi”. Phytochemistry Vol 49, No.7, 2159-2162.
15. G.M.Kitanov, I.Assenov I and Dam The Van (1988), “Flavonols and Xanthones from Cratoxylum prunifloum kurz”, Pharnazie 43, 879 .
16. Goat J.L, Akihisa T.Analysis of steroit frested, pp.324. Chapman & Hall. London, New York - Tokyo.
17. Guat-Lee Sia, Graham J.Bennett, Leslie J.Harrison and Keng-Yeow Sim (1995), “Minor xanthones from the Bark of Cratoxylum cochinchinense”. Phytochemistry, Vol 38, No.6, pp.1521-1528.
18. J. Graham (1993), “et al, triterpenoids, tocotrienols and xanthones from the Bark of cratoxylon cochinchinense”, phytochemistry, Vol 32, No 5, 1245. 19. Lien Hoa Dieu Nguyen, Le Li J. Harrison (1998), “ritecpenoid and
xanthone constituents fo Cratoxylum conchinchinese”, phytochemisty 50, 471-476.
20. Macias, M.Ulloa, M.Ulloa, M. Gamboa, A. and Mata, R. “Phytotoxic comopounds from the new coprophilous fungus Gnanomyces polytlrix”. 21. Munekazu Iinuma, Hideki, Tðtero Ito, Toshiyuki Tanaka and Domingo
A.Madulid (1996), “Two xanthones from roots of Cratoxylum formosanum”. Phytochemistry, Vol, 42, No 4, PP.1195-1198.
22. Nawong Boonnak, Chatchanok Karalai, Suchada Chantrapromma, Channita Ponglimanont, Hoong-Kun Fun (2006), “Bioac tive prenylated xanthones and anthraquinones from Cratoxylum formosun ssp.pruniflorum”. Tetrahedron 62 ,8850-8859.
60
23. Pitchaon Maisuthisakul, Rungnaphar Pongsawatmanit, Michael H.Gordon (2007), “Charaterization of the phytochemicals and antioxidant properties of extracts from Teaw (Cratoxylum fromosum Dyer)”. Food chemistry 100 1620-1629.
24. Sompong Boonsri, Chatchanok Karalai, Chanita Ponglimanont, Akkharawit Kanjana-Opas, Kan Chantrapromma (2006), “Anibac terial and cytotoxic xanthones from the roots of Cratoxylum fomosum”. Phytochemistry 67,723-727. 25. Soon Yew Tang, Matthew Whiteman, Zhao Feng Peng, Andrew Jeniner, Eu
Leong Yong and Barry Halliwell (2004), “Charcterition of Antioxidant and Antiglycation Properties and Isolation of Active Ing redients from Traditional Chinese medicines”. Free Radical Biology & Medicine, Vol.36, No.12, pp.1575-1587, .
26. Soon Yew Tang, Matthew Whiteman, Andrew Jeniner, Zhao Feng Peng and Barry Halliwell (2004), “Mechanisin of cell death induced bi an antioxidant extract of Cratoxylum cochinchinense”, Free Radical Biology and Medicine, Vol 36, No.12,pp, 1588-1611.
27. Xue- Li Cao, Yu Tian, Tian-You Zhang, Yoichiro Ito (2000), “Supercritical fluid extraction of catechins Cratoxylum prunifolium Dyer”. Joumal of Chromatography A, 898, 75-81.
28. Xue- Li Cao, Yu Tian, Tian-You Zhang and Yoichiro Ito (2000), “Beijing Institute of New Technology Application, Xizhimen Southstree” No.16, Beijing 100035, China.
29. W. Mahabusaraka, W. Nuangnaowarat, W.C. Taylor (2006), “xanthone derivativens from Cratoxylum cochinchinense roots”, Phytochemistry 67 470- 474.
30. K. Tawaraya, Y. Takaya, M. Turjaman, S.J. Tuah, S.H. Limin, Y. Tamai, J.Y. Cha, T. Wagatsuma, M. Osaki (2003), “Arbuscular mycorrhizal colonization of tree species grown in peat swamp forests of central kalimantan, indonesia”, Forest Ecology and Management 182, 381- 386.
61
PHỤ LỤC
I. Chất taraxeron Trang
Phổ LC-MS của taraxeron………. 62
Phổ FT-IR của taraxeron...65 Phổ 1
H-NMR của taraxeron………66
Phổ 13
C-NMR của taraxeron………...71
Phổ C13CPD & DEPT của taraxeron……….73 Phổ C13CPD-COSYGP của taraxeron………...78
Phổ C13CPD-HSQC của taraxeron………81
Phổ C13CPD-HMBC của taraxeron………...82
II. Chất stigmasterol
Phổ EI-MS của stigmasterol…….………...84 Phổ FT-IR của stigmasterol ………...85 Phổ 1
H-NMR của stigmasterol………86
Phổ 13
C-NMR của stigmasterol………...87
III. Chất β- Sitosterol
Phổ EI-MS của β- Sitosterol………88
Phổ FT-IR của β- Sitosterol……….89 Phổ 1
H-NMR của β- Sitosterol………90
Phổ 13
C-NMR của β- Sitosterol………...95 Phổ C13CPD & DEPT của β- Sitosterol……….97
IV. Chất axit gallic
Phổ FT-IR củaaxit gallic ………98
Phổ tử ngoại UV của axit gallic... ... 99 Phổ 1
H-NMR của axit gallic………..100
Phổ 13
65
66
Phổ 1
73
78
80
82 Hỡnh…
105 M MỤỤCCLLỤỤCC MỞ ĐẦU ... 1 Chương 1.TỔNG QUAN... 3 1.1. Mụ tả thực vật ... 3
1.2. Một số cụng dụng của chi Cratoxylum... 4
1.3. Tỡnh hỡnh nghiờn cứu húa học thực vật chi Cratoxylum ... 7
1.3.1. Cỏc hợp chất cú khung triterpen ... 7
1.3.2. Cỏc chất axit hữu cơ ... 8
1.3.3. Cỏc chất cú khung xanthone ... 9
1.3.4. Một số đại diện của khung anthraquinon... 15
1.3.5. Một số đại diện của khung flavonoit... 16
1.4. Những nghiờn cứu hoỏ thực vật loài Cratoxylum prunifolium. ... 17
Chương 2.PHẦN THỰC NGHIỆM ... 19
2.1. Đối tượng và phương phỏp nghiờn cứu ... 19
2.1.1. Thu mẫu cõy, xỏc định tờn khoa học và phương phỏp xử lý mẫu ... 19
2.1.2. Phương phỏp phõn lập cỏc hợp chất từ cỏc dịch chiết ... 19
2.1.3. Phương phỏp khảo sỏt và xỏc định cấu trỳc hoỏ học cỏc hợp chất... 20
2.2. Dụng cụ, hoỏ chất và thiết bị nghiờn cứu ... 20
2.2.1. Dụng cụ và hoỏ chất ... 20
2.2.2. Thiết bị nghiờn cứu ... 21
2.3. Cỏc dịch chiết từ cõy đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium Kurtz) ... 21
2.3.1. Cỏc dịch chiết ... 21
2.3.2. Khảo sỏt định tớnh cỏc dịch chiết ... 23
106
2.4. Chiết suất, phõn lập và tinh chế cỏc chất từ cõy đỏ ngọn... 25
2.4.1. Dịch chiết clorofom... 26
2.4.1.1. Taraxeron (Friendoolean - 14- en-3-on) (ĐC1) ... 26
2.4.1.2. Stigmast- 5,22- đien-24R-3β-ol ... 27
2.4.1.3. β- Sitosterol... 27
2.4.2. Dịch chiết trong etylaxetat (ĐE) ... 28
Chương 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIấN CỨU... 29
3.1. Nguyờn tắc chung... 29
3.2. Phõn tớch định tớnh và phỏt hiện cỏc nhúm chất ... 30
3.3. Phõn lập và nhận dạng cỏc hợp chất cú trong cỏc dịch chiết khỏc nhau của cõy đỏ ngọn ... 30
3.3.1. Taraxeron ( hay Frendoolean-14-en-3-on) (ĐC-1) ... 30
3.3.2. Stingmast -5,22-dien-24R-3β-ol (ĐC-2) ... 38
3.3.3. β-sitosterol (ĐC-3) ... 44
3.3.4. Axit gallic (ĐE-1) ... 50
3.4. Thử hoạt tớnh sinh học ... 56
KẾT LUẬN ... 57
KIẾN NGHỊ ... 57
107
D
DAANNHHMMỤỤCCCCÁÁCCBBẢẢNNGG
Bảng 2.1. Khối lượng chất tổng số được chiết từng phõn đoạn lỏ cõy
đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium Kurtz) ... 22 Bảng 2.2. Phỏt hiện cỏc nhúm chất trong cõy đỏ ngọn ... 23 Bảng 2.3. Kết quả thử hoạt tớnh sinh học của dịch chiết thụ từ lỏ cõy đỏ
ngọn (Cratoxylum prunifolium) ... 25 Bảng 3.1. Phổ 13 C-NMR và 1H-NMR của taraxeron (ĐC-1) từ lỏ đỏ ngọn ... 33 Bảng 3.2. Phổ 13 C-NMR của cỏc chất ĐC-2 và stingmasterol [16] ... 39 Bảng 3.3. Phổ 13 C-NMR của cỏc chất ĐC-3 và β-sitosterol [16] ... 45 Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của ĐE-1 và số liệu phổ NMR trong phần
108
D
DAANNHH MMỤỤCC CCÁÁCC HHèèNNHH
Hỡnh 1.1. Ảnh cõy đỏ ngọn (Cratoxylum Prunifolium Kurt, Hypericaceae) ... 4
Hỡnh 2.1. Ảnh được gõy ức chế xung quanh giếng thạch... 24
Hỡnh 3.1 ... 34 Hỡnh 3.2 ... 35 Hỡnh 3.3 ... 36 Hỡnh 3.4 ... 37 Hỡnh 3.5 ... 40 Hỡnh 3.6 ... 41 Hỡnh 3.7 ... 42 Hỡnh 3.8 ... 43 Hỡnh 3.9 ... 46 Hỡnh 3.10 ... 47 Hỡnh 3.11 ... 48 Hỡnh 3.12 ... 49 Hỡnh 3.13 ... 52 Hỡnh 3.14 ... 53 Hỡnh 3.15. Phổ 1 H-NMR của chất axit gallic ... 54
Hỡnh 3.16. Phổ 13 C-NMR của chất axit gallic ... 55
D DAANNHH MMỤỤCC CCÁÁCCSSƠƠĐĐỒỒ Sơ đồ 2.1. Quy trỡnh ngõm chiết ... 22