3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.3.2.2. Xác định số lƣợng tế bào
Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu.
Buồng đếm hồng cầu ngoài việc sử dụng để đếm các tế bào máu, còn dùng để đếm tế bào vi sinh vật có kích thƣớc lớn nhƣ nấm men.
Ngƣời ta thƣờng dùng hai loại buồng đếm hồng cầu: buồng đếm Thomas và buồng đếm Goriep. Nguyên tắc cấu tạo của hai buồng đếm này nhƣ sau: đó là một phiến kính dày hình chữ nhật, chia thành 3 khoảng ngang. Khoảng giữa chia thành hai khoảng nhỏ. Trên mỗi khoảng nhỏ này có kẻ một lƣới đếm, gồm rất nhiều ô vuông. Mỗi ô lớn lại đƣợc chia thành 16 ô vuông nhỏ có diện tích lớn là 1/400 mm2
và chiều cao là 1/10 mm vậy thể tích một ô nhỏ là 1/4000 mm3 . Buồng đếm có lá kính dày để đậy.
Cách thực hiện:
Pha loãng mẫu: lấy 1 g men cho vào ống nghiệm đựng sẵn 9 ml nƣớc muối sinh lý ta đƣợc nồng độ 10-1 và cứ tiếp tục pha loãng mẫu đến 10-4 .
Lắc đều ống nghiệm chứa mẫu đã đƣợc pha loãng ở nồng độ mẫu 10-4 với 5 giọt thuốc nhuộm xanh metylen 0,1%, để yên trong 3 - 5 phút. Tế bào chết sẽ bắt màu xanh nƣớc biển, tế bào sống không màu hoặc phớt xanh.
Đậy lá kính lên lƣới đếm một cách nhẹ nhàng.
Dùng que cấy vòng lấy mẫu, cho một giọt vào mép lá kính, do sức mao dẫn dịch tự tràn vào mặt trên lƣới đếm.
Đặt buồng đếm lên kính hiển vi, sau đó tiến hành đếm tế bào trong 5 ô lớn chéo nhau. Trong mỗi ô lớn, đếm lần lƣợt từ ô con thứ nhất đến ô con thứ 16. Chỉ đếm những tế bào nằm bên trong ô con và những tế bào nằm trên hai cạnh liên tiếp cùng chiều. Ghi số lƣợng tế bào đếm đƣợc trong 5 ô lớn (80 ô con).
Dùng xong buồng đếm và lá kính phải rửa ngay và lau khô. Mẫu sau khi sấy để 24 h trƣớc khi đếm hồng cầu
Số lƣợng tế bào trong 1 ml mẫu nghiên cứu đƣợc tính bằng công thức 3.3 X = a * 4000 * 103 * 10n / b
Trong đó:
X: số tế bào/ml (cfu/g)
a: số tế bào trong 5 ô lớn (80 ô con) b: số ô con trong 5 ô lớn (b = 80) 103: số chuyển mm3 thành ml
10n: độ pha loãng mẫu
Ngoài ra để tăng phần chính xác của số liệu cần đếm thêm 4 ô nữa nằm trên hai đƣờng vuông góc của buồng đếm. Nguyên tắc chọn 4 ô đó nhƣ sau: chọn những ô mà số tế bào còn sống xuất hiện nhiều. Số lƣợng tế bào vẫn đƣợc tính theo công thức trên chỉ thay giá trị b là số ô con trong 9 ô lớn (b = 144).