s% Sự phát hiện phản ứng Anammox
Thật ra, phản ứng anammox đã được dự báo từ trước khi được phát hiện (Broda,
1977). Trên cơ sở tính toán nhiệt động học, Broda đã dự báo sự tổn tại của các vi khuẩn tự dưỡng hóa năng có khả năng oxy hóa Ammonium bởi nitrat, nitrit và thậm chí về mặt. năng lượng còn dễ xảy ra hơn sự oxy hóa bởi oxy phân tử:
NH¿+NO; V N;+ 2 H;ạO G° = -357 kJ]/mol (9)
5 NH¿' + 3NO; V4N;+9H;O + 2 H' G°= -297 kJ/möl (10) -
NHệ + L5 O; V NOÿ +2H*+H,O G0=-275 KJ/mol(1) —
Mãi 17 năm sau đó, bằng chứng thực tế đầu tiên của phản ứng anammox mới được
phát hiện ở một bể denitrat hóa xử lý nước lắng của bể phân hủy bùn tại Gist-brocades -
(Detft, Hà Lan) (Mulder et al., 1995). Qua theo dõi cân bằng nitơ, các tác giả đã phát
——--=-=-.-.-sễỶr-.-.-Ỷ-...rnrararrBBBBRRRnnananaagannnanaaaaannnnnnnnnnnnn TRẦN THỊ LINH PHƯƠNG - MSSV: 10107077 Trang 38
Khảo sát mô hình xử lý Anuonium bằng CNSH NASU
hiện thấy sự giảm đồng thời nồng độ Amonium và nồng độ nitrat, nitrit cùng sự tạo thành
nitơ phân tử ở điều kiện ky khí.
Trong một vài năm tiếp theo, nhóm Đại học Kỹ thuật Deft (TU-Deft) đã có các nghiên cứu xác nhận và mô tả ban đầu về anammox được công bố (Van De Graaf et aL.,
1995; Van De Graaf et al., 1996; Van De Graaf et al., 1997). Theo đó, anammox được xác định có bản chất là quá trình sinh học, Ammonium được oxy hóa dưới điều kiện ky
khí với nitrit là phần nhận điện tử, tạo thành nitơ phân tử. .
Tiếp theo phát hiện của nhóm TU-Deft, phản ứng anammox cũng đã lần lượt được
phát hiện và xác nhận trên các hệ thống xử lý nước thải bởi các nhà nghiên cứu ở các nơi
khác như Đức (Schmid et al., 2000); Nhật (Furukawa et al., 2000); Thụy Sĩ (Egli et al., 2001); Bỉ (Pynaert et al., 2002); Anh (Schmid et al., 2003).
Sự phát hiện vi khuẩn Anamznox ở các hệ thống xử lý nước thải đã dẫn các nhà khoa học đến sự tìm kiếm trong các hệ sinh thái tự nhiên. Phản ứng anammox đã được chứng minh đóng đến 50% vai trò trong việc tạo khí nitơ trong trầm tích biển Baltic (Thamdrup
và Dalsgaard, 2002), trong vùng nước thiếu khí dưới đáy đại dương ở Costa Rica (Dalsgaard et al., 2003). Các vi khuẩn Anammox thuộc một chỉ mới đã được phát hiện trong vùng nước gần đáy Biển Đen (Kuypers et al., 2003).
Trên cơ sở các phát hiện vi khuẩn và phản ứng anammox, chu trình chuyển hóa nitơ
tự nhiên có trong sách giáo khoa từ lâu nay đã được bổ sung một mắc xích mới và được
viết lại.
=“====—.—====a LEO TRẦN THỊ LINH PHƯƠNG - MSSV: 10107077 Trang 39
Khảo sát mô hình xử lý Ammonium bằng CNSH NASU
NOx
Nitrat hoá
Hình 2. Chu trình nitơ mới có thêm mắc xích Áwarmrnox
Các nghiên cứu mô tả chỉ tiết về hóa sinh học, vi sinh học, sinh học phân tử,.. . của
Anammox tiếp tục phát triển mạnh từ cuối thập niên 1990 đến nay, đã làm rõ nhiều khía
cạnh của Anammox về mặt hóa sinh học, vi sinh học, sinh học phân tử, ... - ® Hóa sinh học của Anammox
e Phương trình phẩn ứng
Như đã nói ở trên, phản ứng Anammox đã được xác nhận là sự oxy hóa ammonium
bởi nitrit, phản ứng hóa học đơn giản với tỉ lệ mol NH¿” : NO; = 1:1 như ở phương trình
(9).
Trên cơ sở cân bằng khối lượng từ thí nghiệm nuôi cấy làm giàu với kỹ thuật mẻ
liên tục (SBR), có tính đến sự tăng trưởng sinh khối, phản ứng anammox được xác định với các hệ số tỉ lượng như sau (Strous et al., 1999):
: Anammox
NH¿ +NO; —> N;ạ+2 HO
Cụ thể là:
NH¿' + 1.32 NO; + 0.066 HCO; +0.13H” V 1.02N;+0.26NOz
Khảo sát mô hình xử lý Ammonium bằng CNSH NASU
—.ớ.-...
+ 0.066 CH;OgszNạ¡z + 2.03 HO (12)
Trong đó sự tạo thành lượng nhỏ nitrat từ Nitrit được giả thiết là để sinh ra các
đương lượng khử khi đồng hóa CO¿. Phương trình này đã được chấp nhận rộng rãi như là đại diện cho phản ứng anammox khi tính toán, giải thích,...
e Cơ chế sinh hóa:
Cơ chế chuyển hóa nội bào của phản ứng anammox đến nay vẫn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn. Sử dụng phương pháp đồng vị đánh dấu (N), cơ chế sinh hóa của
anammox được để nghị như hình dưới đây (J etten et al., 2001).
—NH,OH< Cytoplasm INH‡ Anammoxosome WV— N;H„ X
Hình 3: Cơ chế sinh hóa quá trình Anammox
NR: Enzyme khử Nitrit (sản phẩm giả thiết là NH2OH); HH: Hydrazine Hydrolase,
Enzyme xúc tác tạo Hydrazyne từ Ammonium và Hydroxylamine; HZO: Enzyme oxy hóa Hydrazine (tương tự Enzyme Hydroxylamine Oxidoreductase tức HAO ở các
Nitrosomonas); Cytoplasm:tế bào chất.
Theo đó, quá trình đi qua sản phẩm trung gian là Hydrazine (N;H¿). HZO, một -| enzyme tương tự như HAO trong oxi hóa hiếu khí Ammonium, sẽ xúc tác cho sự oxy hóa Hydrazine thành nitơ phân tử (AG? = -288 kJ/mol). Các điện tử từ quá trình oxy hóa này
lntracytoplasm ; . Call wall
Paryphoplasm _ Cytoplasmic
membrane
Hình 4: Sơ đồ phân khoang tế bào Azazrwnoxy (Nguồn: Van Niftrik et al., 2004)
Cell wall: thành tế bào; lntracytoplasm:
màng trong tế bào chất; Cytoplasmic
mbrane: màng tế bào chất; Nucleoid: thể nhân.
Khảo sát mô hình xử lý Ammonium bằng CNSH NASU
Một điểm khá thú vị liên quan đến enzyme đặc trưng HZO của vi khuẩn Anammox. HZO được biết có cấu trúc tương tự HAO trong các vi khuẩn Niirosomonas, tức là chứa các Cytochrome c (cyt c) với các haem c và haem hấp thụ mạnh ở 468 nm (tương tự P460
của HAO) (Jetten et al., 2001). Vì ion trung tâm của các haem này là sắt (Fef và Fe,
nên các vi khuẩn Azamzmmox có màu đỏ đặc trưng nếu quần tụ ở mật độ lớn. Việc quan sát
sự xuất hiện màu đồ là một chỉ dấu tốt cho sự phát hiện vi khuẩn Anammox.
Hình 5:Cơ chế chuyển hoá của Anammox
% Vi sinh học của Anammox
e© Định danh và phân loại vi khuẩn Anammox:
Đến nay đã có 3 chi của vi khuẩn Anammox được phát hiện, gồm Brocadia,
Kuenenia và Scalindua. Về mặt. phân loại, các vi khuẩn Anzmnox là những thành viên mới tạo thành phân nhánh sâu của ngành Pianctomycetes, bộ Planctoycetales (Schmid et
al., 2005).
Ở trường hợp phát hiện đầu tiên, bùn ky khí được nuôi cấy làm giàu bằng phương pháp mẻ liên tục (SBR), vi khuẩn được tách bằng kỹ thuật ly tâm gradient tỷ trọng, chiết
TRẤN THỊ LINH PHƯƠNG - MSSV: 10107077 Trang 43
Khảo sát mô hình xử lý Anunonium bằng CNSH NASU
xuất DNA, rồi tiến hành phân tích trình tự 16S rDNA. Kết quả phân tích trình tự cho thấy
vi khuẩn thuộc vào phân nhánh P!zncfomycete sâu và vi khuẩn đã được đặt tên là
Candidatus Brocadia anammoxidans. Brocadia lấy từ tên của nơi đặt trạm xử lý pilot đã
phát hiện ra vi khuẩn, Gist-brocades (Strous,: 1999), Planctomycetales được biết là một
nhóm các vi khuẩn có nhiều đặc điểm riêng biệt như thành tế bào không chứa
peptidoglycan, sinh sản bằng đâm chổi, phân khoang nội bào,.. .etten et al., 2001).
Trên cơ sở phân tích 16S rDNA, năm 2000, các vi khuẩn Anammox được phát hiện
ở hệ thống xử lý RBC ở Stuttgart (Đức) được xác định là mới (độ tương tự dưới 90% so
với B.Anammoxidans) và được đặt tên là Candidatus Kuenenia Stuttgartiensis (Schmid _
et al.,2000). Sau đó, vi khuẩn Anammox được phát hiện ở Thụy Sĩ (Egli et al., 2001):,Bỉ (Pynaert et al., 2002 cũng được xác định chính là Candidatus Kuenenia Stuttgartiensis).
Ở PTN thuộc ĐH Kumamoto (Nhật Bản), trong quá trình nuôi cấy liên tục ở điều
kiện ky khí, tự dưỡng, trên vật liệu bám là một dạng polyester được thiết kế đặc biệt.
(non-woven), phản ứng Anammox và dấu hiệu màu đồ đặc trưng của vi khuẩn anammox
đã được phát hiện (Purukawa et al., 2000). Kết quả phân tích trình tự 16S rDNA trên vi
sinh vật tử màng sinh học sau đó đã phát hiện các vi khuẩn Anammox chỉ có độ tương tự
32.2% với C.Brocadia anammoxidans và tương tự rất thấp với các nhóm khác đã biết
trước đó. Trên cơ sở đó, một dòng Anammox mới, ký hiệu là KSU-1 đã được xác lập
trong các Planctomycetes (Fujii et al., 2002).
Lần đầu tiên, vi khuẩn Anamnox được phát hiện trong hệ sinh thái tự nhiên là vùng
nước nghèo oxy ở Biển Đen. Kết quá phân tích trình tự 16S rDNA cho thấy 87.9% và
87.6% tương tự với các vi khuẩn Kuenenia và Brocadia đã biết, nghĩa là vi khuẩn phát
hiện được là một chi khác, và đã được đặt tên là Candidatus Scalindua Sorokinii
(Kuypers et al., 2003).
—snnnnEnEnErnỷỷỳsnRỷRODODOoOooooooOOOOOEEODEDODDEDEEEDEEnSDnEAHnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnngnn nung TRẤN THỊ LINH PHƯƠNG ~ MSSV: 10107077 Trang 44
Khảo sát mô hình xử lý Ammomium bằng CNSH NASU
—————_—————...—
Các loài Anzrmmmox khác đã được phát hiện tử đĩa quay sinh học nitrat hóa tại một
nhà máy xử lý nước thải ở Pitsea ( Anh). Kết quả mô tả và phân tích trình tự 16S RNA
cho thấy chúng thuộc cùng chỉ Scalindua, và đã được đặt tên là Candidatus “Scalindua
Brodae”, Candidatus “Scalindua wagneri”. Độ tương tự của trình tự 16S rRNA giữa hai
loài là 93% (Schmid et al., 2003).
Một trong các vấn để là các vi khuẩn Anamnox sinh trưởng rất chậm (thời gian
nhân đôi hơn 3 tuân), nên việc nuôi cấy, phân lập gặp nhiều khó khăn. Tuy nhiên, nhờ vào kỹ thuật sinh học phân tử, việc c phát hiện trực tiếp trên mẫu sống (insitu) và định danh các vi khuẩn Anammox đã được thực hiện thuận lợi. Hàng chục “cực dò ” nucleotide (oligonucleotde probes) dùng cho việc phát hiện bằng FISH (fluorescent in situ
hybridization) và nhiều đoạn mổi (primers) đặc trưng cho phản ứng PCR khuếch đại gen
16S rDNA của vi khuẩn Anzammox đã được thiết kế (Schmid et al., 2005).
Một vấn để tổn tại đang được tiếp tục nghiên cứu là mặc dù giữa 3 chỉ Anaznox đã biết có chung tổ tiên, nhưng hơi xa nhau về mặt tiến hóa (độ tương tự nhỏ hơn 85% dựa
trên 16S rDNA); trong khi chúng có những tương đồng về mặt tuýp (phenotype):sinh trưởng với tốc độ chậm như nhau, đều có anammoxosome, lớp màng chứa các lipid
ladderance. B AB 015662
Canditarus "Scalindua brodae" Candirarus " Kueneria stutrgarriensis” : Candidatus " Brocadia anammoxidans" candiratus "Scalindua sorokini"
AF 424478 AB 057453
AF424463
. Canditatus "Scalindua wagneri" 010
†0 Ou†groups
Hình 6: Cây phát sinh loài của các vi khuẩn Anammox e©_ Một số đặc điểm sinh lý của vi khuẩn anammox
CC nnn=ẵnẵăẳăăăằ=nẵnnmrnnmmmmmmmmnmmmmmm TRẦN THỊ LINH PHƯƠNG - MSSV: 10107077 Trang 4S
Khảo sát mô hình xử lý Ammonium bằng CNSH NASU
”...
Anammox được biết có thể hoạt động trong khoảng nhiệt độ từ 20 đến 43°C ( tối ưu
ở 40°C), pH 6.4 — 8.3 ( tối ưu ở pH 8.0). Ở điều kiện tối ưu, tốc độ tiêu thụ cơ chất riêng
cực đại là 55 mol NHạ-N/g protein/min. Ái lực với các cơ chất amonium và nitrit rất cao
(hằng số ái lực dưới 10 nM). Ở nộng độ 100 mM, amoniac và nitrat không ức chế bởi
Nitrit ở nồng độ trên 20 mM. Khi tiếp xúc với nông độ nitrit trên 5 mM trong thời gian
đài (12h), hoạt tính anammox bị mất hoàn toàn. Tuy nhiên hoạt tính sẽ được hôi phục khi.
thêm lượng vết (50 M) một trong các sản phẩm trung gian của phản ứng anammox là Hyđrazin hay Hydrolamin. Hoạt tính anammox bị ức chế hoàn toàn ở nồng độ oxy trên
0.5% bão hoà không khí ( Strous et al., 1999).
Khảo sát mô hình xử lý Ammonium bằng CNSH NASU
Bảng 6: Một số đặc trưng sinh lý của vi khuẩn và phản ứng Anammox
Thông số Đơn vị Anammox AOB
NH¿ ¿NOz —-N; | NH+O;—>
_ _ NO;
AG@° kl/mol- -357 -275
Y _mol-C/mol-N 0.066 0.08
dma„ hiếu khí | nmol/min/mg/protein 0 -_ 200 - 600
quay kỳ khí nmol/min/mgprotein 60 2 Hmax ⁄h 0.003 0.04 DT ngày 10.6 0.73 K,(NH¿*) uM b 5 — 2600 K, (NOz;) uM _<5 K.A K, (O;) uM K.A 10-50
Chú thích: AG°~ năng lượng tự do, Y - hiệu suất tạo sinh khối, q„ạ„ - hoạt tính cực